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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2026-05-10 16:49
藥品中N-亞硝胺（NAs）雜質(zhì)相關(guān)的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)已引發(fā)顯著關(guān)注。監(jiān)管指南建議通過制定可接受攝入量限值（AIs）的方法來保護(hù)終生每日暴露的安全性。然而，對(duì)于使用時(shí)間短于終生（LTL）的藥品中NA雜質(zhì)是否適用相同限值仍存疑問。ICH M7(R2)指南針對(duì)致突變雜質(zhì)，通過為L(zhǎng)TL暴露設(shè)定更高AIs來解決該問題；但當(dāng)前針對(duì)歸屬"關(guān)注隊(duì)列"（潛在高效致癌物）的NA雜質(zhì)監(jiān)管指南尚未采納此方法。本研究填補(bǔ)了關(guān)鍵知識(shí)空白：NA的致癌效力取決于總暴露量而非劑量速率——這正是ICH M7(R2)中LTL處理方案的核心原則。
通過評(píng)估八種NAs及黃曲霉毒素B1（另一種高效致癌物）在21至120周暴露周期內(nèi)的嚙齒動(dòng)物致癌性生物測(cè)定數(shù)據(jù)，所有案例研究均表明致癌效力由累積總劑量決定，與日劑量無關(guān)。這與ICH M7(R2)指南主張"LTL周期可適用更高AI限值"的立場(chǎng)一致。
1. 介紹
過去六年中，制藥污染物中發(fā)現(xiàn)的N-亞硝胺（以下簡(jiǎn)稱NAs）引發(fā)的潛在健康問題受到高度關(guān)注，其中新型NAs（常與原料藥本身相關(guān)）缺乏傳統(tǒng)嚙齒動(dòng)物致癌性數(shù)據(jù)。2020年首次發(fā)布關(guān)于評(píng)估藥品中NA雜質(zhì)的監(jiān)管建議，并隨科學(xué)進(jìn)展多次更新。當(dāng)化合物特異性數(shù)據(jù)不足時(shí)，可采用致癌效能分級(jí)法（CPCA）設(shè)定可接受攝入限值（AI）。
CPCA依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)考量（Kruhlak等，2024）將AI限值分為五級(jí)（18/26.5至1500納克/天），預(yù)計(jì)將隨科學(xué)發(fā)展持續(xù)完善（如Ponting等，2025）。懸而未決的問題是：針對(duì)終生每日使用藥品設(shè)定的NA雜質(zhì)AI限值，是否適用于短期或間歇用藥情形？
ICH M7(R2)指南（ICH, 2023；見第1.3節(jié)）通過建立暴露時(shí)間縮短則AI限值遞增的機(jī)制，為誘變性雜質(zhì)提供了通用解決方案。但該指南對(duì)NAs的適用性存疑，部分因其被歸為"關(guān)注類別"（CoC）——基于其可能具有強(qiáng)致癌性（見第1.4節(jié)）。
為此，健康與環(huán)境科學(xué)研究所（HESI）在其亞硝胺研究計(jì)劃（https://hesiglobal.org/gttc-nitrosamines/）框架下啟動(dòng)研究項(xiàng)目，通過系統(tǒng)評(píng)估已發(fā)表的NA嚙齒動(dòng)物致癌性文獻(xiàn)（重點(diǎn)關(guān)注暴露時(shí)長(zhǎng)影響），探究ICH M7指南中短期暴露（LTL）原則對(duì)NAs的適用性。
本文雖會(huì)區(qū)分短期暴露與間歇暴露，但"LTL"將沿用ICH M7指南定義（ICH, 2023）統(tǒng)指兩種情形。本文呈現(xiàn)該研究成果，并通過回顧定量癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估起源及ICH M7建立誘變性雜質(zhì)LTL暴露限值的科學(xué)基礎(chǔ)，為研究奠定理論框架。
1.1 癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：歷史與起源
1969年，首個(gè)采用美國(guó)國(guó)家癌癥研究所標(biāo)準(zhǔn)化方案的嚙齒類生物測(cè)定研究報(bào)告發(fā)表；1976年《嚙齒類生物測(cè)定指南》隨之問世（Innes等, 1969; NCI, 1976），由此開啟了未來數(shù)十年化學(xué)致癌物定量評(píng)估方法的發(fā)展與演進(jìn)。自那時(shí)起直至今日，定量癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估傳統(tǒng)上（且最普遍地）基于慢性嚙齒類生物測(cè)定的劑量效應(yīng)數(shù)據(jù)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和環(huán)境保護(hù)署（EPA）作為首批監(jiān)管機(jī)構(gòu)，于1970年代發(fā)布了致癌物定量健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南（詳見Albert, 1994; Rodricks, 2019）。兩大機(jī)構(gòu)最初指南要求：通過多種統(tǒng)計(jì)方法對(duì)高劑量嚙齒類生物測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行低劑量外推，從而確立被認(rèn)為對(duì)人類構(gòu)成可忽略風(fēng)險(xiǎn)的暴露限值——該限值理論上代表經(jīng)食物或環(huán)境介質(zhì)每日終生暴露所導(dǎo)致的、超出本底水平的百萬分之一超額風(fēng)險(xiǎn)。
隨著時(shí)間的推移，嚙齒類生物測(cè)定方案的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范不斷調(diào)整，監(jiān)管指南也隨之演進(jìn)（并發(fā)布了新版本），以提供更精細(xì)的優(yōu)化建議（Bucher, 2002; 美國(guó)FDA, 2006; ICH, 2022; NCI, 1976; OECD, 1981, 2018; Weisburger, 1983）。這些指南普遍認(rèn)同：對(duì)于作用機(jī)制存在閾值的致癌物與默認(rèn)無閾值的致癌物需采取不同的評(píng)估方法。后者包括已知或推定具有致突變作用機(jī)制的致突變性（DNA反應(yīng)性）致癌物。對(duì)此類化合物，通過嚙齒類生物測(cè)定的腫瘤劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)確立基準(zhǔn)點(diǎn)，并以此為起點(diǎn)畫一條直線，作為建立人類健康風(fēng)險(xiǎn)值的依據(jù)。
針對(duì)藥物中的致突變性雜質(zhì)，ICH M7指南（ICH, 2023）明確規(guī)定：采用嚙齒類TD50值（終生每日暴露下導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率較背景值增加50%的劑量率）作為基準(zhǔn)點(diǎn)，由此確立以μg/天為單位的AI值，對(duì)應(yīng)理論致癌風(fēng)險(xiǎn)為十萬分之一。對(duì)于缺乏足夠數(shù)據(jù)推導(dǎo)化合物特異性AI值的致突變性雜質(zhì)，則采用基于毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的每日1.5 μg限量標(biāo)準(zhǔn)。
盡管嚙齒動(dòng)物癌癥生物測(cè)定法和現(xiàn)行監(jiān)管指南在過去五十年間不斷發(fā)展，但某些重要?dú)v史視角仍對(duì)當(dāng)今人類健康防護(hù)具有現(xiàn)實(shí)意義——尤其針對(duì)不符合嚙齒動(dòng)物生物測(cè)定中終身日常暴露模式的致癌物接觸（即短期暴露）。早在美國(guó)國(guó)家癌癥研究所首次開展生物測(cè)定之前的數(shù)十年研究中，科學(xué)家們致力于解析決定化學(xué)物質(zhì)致癌能力的關(guān)鍵因素，以及不同暴露條件如何影響致癌效力，這些重要發(fā)現(xiàn)同樣具有深遠(yuǎn)價(jià)值。
2. 終生累積劑量（LCD）：癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的劑量指標(biāo)
癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估傳統(tǒng)上基于一個(gè)前提：致癌效力取決于終生接收的總劑量。這一假設(shè)最初的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)來自嚙齒動(dòng)物研究中給藥方案與結(jié)果關(guān)聯(lián)性的探索。該領(lǐng)域最早的文獻(xiàn)之一——Druckrey與Kupfmuller（1948年）在奶油黃（3′-甲基-4-二甲氨基偶氮苯）研究中總結(jié)出以下核心發(fā)現(xiàn)：
• "無論給藥周期分布在34天至1年間的哪個(gè)時(shí)段，誘發(fā)腫瘤需要達(dá)到特定的奶油黃總劑量。在此范圍內(nèi)，潛伏時(shí)間與日劑量水平呈反比關(guān)系。"
• "誘導(dǎo)癌癥所需的奶油黃總劑量可視為現(xiàn)有癌癥易感性強(qiáng)度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。"
Druckrey和Kupfmuller（1948）同樣認(rèn)識(shí)到這一普遍原理適用于他們提出的"Ct毒素"概念，其中"C"代表毒素的恒定濃度，"t"代表暴露時(shí)間。當(dāng)時(shí)該規(guī)律僅在短期暴露（數(shù)小時(shí)至數(shù)天）中得到驗(yàn)證，但Druckrey和Kupfmuller（1948）推測(cè)該關(guān)系同樣適用于由不可逆變化（包括突變）引發(fā)的效應(yīng)，即存在"效應(yīng)累積"現(xiàn)象。作者進(jìn)一步類比X射線誘發(fā)的突變，指出突變總數(shù)由輻射總劑量決定。
二十年后，Druckrey（1967）基于上萬只大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)總結(jié)了暴露量與致癌結(jié)果的關(guān)系。其團(tuán)隊(duì)開展的對(duì)照研究專門聚焦致癌作用的"時(shí)間因子"，明確證實(shí)腫瘤發(fā)生取決于動(dòng)物累積接收的劑量，而非日劑量。該原理雖常被稱為終生累積劑量（LCD），實(shí)則具有更廣泛的適用性，亦涵蓋短期研究中動(dòng)物接收的累積劑量。
這一理論在4-二甲基氨基偶氮苯的突破性研究中得到驗(yàn)證：維持大鼠日給藥劑量恒定為5毫克/天，暴露周期從40天至200天不等（采用"終止暴露"實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，動(dòng)物在停止給藥后仍持續(xù)觀察至研究期滿），LCD相應(yīng)為200至1000毫克/只。肝癌發(fā)生率隨暴露大鼠比例從20%升至81%，與LCD呈近似線性增長(zhǎng)?；诖思岸囗?xiàng)研究，Druckrey（1967）得出結(jié)論："致癌作用應(yīng)視為所有連續(xù)給藥總劑量的函數(shù)"。
特別是在亞硝胺研究中，早期嚙齒動(dòng)物致癌性文獻(xiàn)除日攝入劑量外，普遍提及"單只動(dòng)物累計(jì)劑量"并不令人意外。事實(shí)上，Druckrey（1967）在關(guān)于N-亞硝基二乙胺（NDEA）的實(shí)驗(yàn)室研究中也采用了這種表述方式。Lijinsky等人（1988）發(fā)表的亞硝胺致癌性數(shù)據(jù)匯總表顯示，其僅采用"單只動(dòng)物累計(jì)劑量（單位：毫摩爾）"作為有效劑量評(píng)估指標(biāo)。
1.3 癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的亞終生暴露考量
美國(guó)環(huán)保署在1986年頒布癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南時(shí)，已有充分證據(jù)表明嚙齒類動(dòng)物的腫瘤發(fā)生率與終生總給藥劑量相關(guān)（US EPA, 1986）。重要的是，支撐該結(jié)論的實(shí)證數(shù)據(jù)與致突變作用模式致癌物的特性一致——已知突變會(huì)在整個(gè)生命周期中累積；該結(jié)論也與公認(rèn)的年齡與多數(shù)癌癥的關(guān)聯(lián)性相符（如Harrison與Doe，2021）。由于環(huán)保署常需評(píng)估那些未體現(xiàn)終生每日暴露的人類暴露場(chǎng)景（不同于1960年代末標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程中的嚙齒動(dòng)物生物測(cè)試方案），1986年指南對(duì)此挑戰(zhàn)作出明確說明：
"當(dāng)關(guān)注的人類暴露情境（如暴露途徑和給藥方案）與相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在顯著差異時(shí)，會(huì)產(chǎn)生特殊問題。除非個(gè)案存在反證，否則建議采用終生累積劑量（以終生按日平均計(jì)算的暴露量表示）作為致癌物暴露的適宜度量。即假設(shè)短期內(nèi)接受高劑量致癌物與終生接受相應(yīng)低劑量暴露具有等效性"（US EPA, 1986）。
因此，LCD（終生致癌劑量）和LADD（終生平均日劑量）的概念已成為癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，并被ICH M7指南所認(rèn)可。該指南指出："對(duì)已知致癌物的標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估假設(shè)癌癥風(fēng)險(xiǎn)隨累積劑量增加而升高。因此，終生連續(xù)低劑量暴露的癌癥風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)當(dāng)?shù)韧谳^短時(shí)間內(nèi)的相同累積暴露所產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。"由于1970年代后開展的大多數(shù)嚙齒動(dòng)物試驗(yàn)均采用終生每日暴露模式，LADD常與試驗(yàn)劑量重合，故LCD與LADD概念未被廣泛討論。但在評(píng)估非終生每日暴露的嚙齒動(dòng)物致癌試驗(yàn)，或評(píng)估人類短期/間斷暴露（LTL暴露）時(shí)，這些概念至關(guān)重要。
嚙齒動(dòng)物致癌試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方案通常要求每日暴露持續(xù)24個(gè)月（默認(rèn)壽命周期），其得出的風(fēng)險(xiǎn)值旨在為類似暴露模式的人群提供保護(hù)，并成為制定空氣/食品/飲用水雜質(zhì)限值等慢性暴露監(jiān)管的重要依據(jù)。然而許多人類暴露場(chǎng)景并非終生連續(xù)暴露，例如空氣/食品/水的短期污染事件，或符合嚴(yán)格雜質(zhì)限值的消費(fèi)品短期/間斷使用場(chǎng)景。部分監(jiān)管指南（美國(guó)環(huán)保局2005；毒物與疾病登記署；加州環(huán)保局2001）建議通過LADD折算人類暴露量，再與慢性動(dòng)物試驗(yàn)確立的癌癥風(fēng)險(xiǎn)值比對(duì)。相比之下，對(duì)藥物中的致突變雜質(zhì)則采取修正癌癥風(fēng)險(xiǎn)值（即AI，允許攝入量）的策略，允許短期更高暴露（見1.4節(jié)）。
關(guān)鍵的是，雖然LCD和LADD作為癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要?jiǎng)┝恐笜?biāo)已被廣泛接受，但在癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中如何應(yīng)用這些指標(biāo)仍存在疑問，尤其當(dāng)暴露持續(xù)時(shí)間縮短時(shí)。這一點(diǎn)在美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）1986年發(fā)布的注意事項(xiàng)中得到突顯，該機(jī)構(gòu)認(rèn)識(shí)到若將LCD壓縮至過短時(shí)限會(huì)產(chǎn)生重大局限："當(dāng)相關(guān)暴露強(qiáng)度增加但頻率降低時(shí)，特別是當(dāng)有證據(jù)表明該物質(zhì)存在劑量率效應(yīng)時(shí)，此方法會(huì)變得更成問題"（US EPA, 1986）。
盡管當(dāng)時(shí)已認(rèn)識(shí)到這是應(yīng)用LTL的局限性，但尚未提出推薦解決方案。這一局限，加上對(duì)LTL暴露考量方式缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，促使國(guó)際生命科學(xué)研究所（ILSI）和HESI聯(lián)合開展研究項(xiàng)目。2009年召開的研討會(huì)匯集了來自工業(yè)界、監(jiān)管機(jī)構(gòu)、學(xué)術(shù)界和非政府組織（NGO）的癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專家，最終形成出版物提出了包含決策樹和指導(dǎo)原則的LTL暴露癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估框架（Felter等, 2011）。該框架成為ICH M7關(guān)于藥物致突變雜質(zhì)LTL癌癥風(fēng)險(xiǎn)指南的基礎(chǔ)（首次發(fā)布于2014年，并持續(xù)更新至2023版指南）。
1.4. 關(guān)于致突變雜質(zhì)有限治療期（LTL）的ICH M7指導(dǎo)原則
許多藥物僅適用于短期治療，在患者生命周期內(nèi)不會(huì)長(zhǎng)期使用，例如麻醉劑或抗生素。同樣，臨床試驗(yàn)中的候選藥物通常僅限定期使用。其他藥品可能持續(xù)使用數(shù)十年但僅為間斷性需求（如感冒藥和其他非處方產(chǎn)品）。為考量LTL暴露，Müller等人（2006年）提出分階段TTC概念用于藥品致突變雜質(zhì)，該方案經(jīng)修訂后被納入2014年ICH M7指導(dǎo)原則。1.5微克/天的TTC被視為致突變雜質(zhì)的可接受攝入量（AI），基于致癌物效能的線性反向外推法，其終生暴露理論致癌風(fēng)險(xiǎn)不超過十萬分之一。ICH M7默認(rèn)人類壽命為70年（25,550天），按TTC每日終生暴露累計(jì)劑量為38.3毫克（即1.5微克×25,550天）。
ICH M7指導(dǎo)原則同時(shí)為建立LTL暴露的AI提供建議：由于暴露持續(xù)時(shí)間縮短可能導(dǎo)致效能濃度（LCD）增強(qiáng)，針對(duì)單個(gè)雜質(zhì)的推薦AI隨暴露期縮短采用漸進(jìn)增大的安全系數(shù)（見表1）。該指導(dǎo)原則還涉及多致突變雜質(zhì)LTL暴露的處理方案。
對(duì)于間歇給藥（如每周僅用藥一次），同樣適用LTL概念。此時(shí)應(yīng)根據(jù)總給藥天數(shù)計(jì)算暴露持續(xù)時(shí)間，對(duì)應(yīng)上述四種定義的暴露期類別及LTL-AI標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)具備可靠致癌性數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)采用化合物特異性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估替代TTC方法。默認(rèn)方案是通過最相關(guān)致癌性研究的TD50值進(jìn)行線性外推，此為確定已知致突變致癌物AI的首選方法。表1所述的LTL-AI限值比例可同樣用于化合物特異性AI，以調(diào)整較短治療周期。例如：對(duì)于≤1個(gè)月、≥1-12個(gè)月、≥1-10年的暴露期，LTL調(diào)整因子分別比慢性/終生AI高80倍（120/1.5微克/天）、13.3倍（20/1.5微克/天）和6.7倍（10/1.5微克/天）。
1.5. 嚙齒動(dòng)物TD50：基于亞終身（LTL）嚙齒動(dòng)物生物測(cè)定進(jìn)行AI計(jì)算的調(diào)整
致突變雜質(zhì)可接受攝入量（AIs）的制定基于從嚙齒動(dòng)物TD50值線性外推至十萬分之一理論超額致癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，理解TD50的計(jì)算方法至關(guān)重要——尤其當(dāng)數(shù)據(jù)源自未涉及終身暴露和/或非標(biāo)準(zhǔn)研究周期的嚙齒動(dòng)物生物測(cè)定時(shí)。TD50定義為"在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)周期（該物種的'標(biāo)準(zhǔn)壽命'）結(jié)束時(shí)，使經(jīng)精算調(diào)整的無腫瘤動(dòng)物比例減半的慢性劑量率（單位：mg/kg體重/天）"（Peto等, 1984）。對(duì)于涉及亞終身（LTL）給藥和/或研究周期長(zhǎng)于或短于標(biāo)準(zhǔn)壽命（嚙齒類為104周）的生物測(cè)定，需進(jìn)行定量調(diào)整：
首先，調(diào)整給藥劑量以反映嚙齒動(dòng)物在研究周期內(nèi)接受的平均日劑量，該劑量將用于劑量反應(yīng)模型推導(dǎo)TD50。若研究周期短于（或長(zhǎng)于）標(biāo)準(zhǔn)壽命，則需二次調(diào)整TD50。因?yàn)橐阎K生致癌風(fēng)險(xiǎn)隨年齡增長(zhǎng)而升高，對(duì)于早于或晚于標(biāo)準(zhǔn)兩年壽命終止的嚙齒動(dòng)物致癌性生物測(cè)定，需特別考量其相比終身生物測(cè)定對(duì)腫瘤結(jié)果的預(yù)期影響。
為修正研究周期的影響，Peto等（1984）建議TD50應(yīng)納入f²d的調(diào)整因子（其中f定義為實(shí)驗(yàn)周期/標(biāo)準(zhǔn)壽命，d為劑量率）。例如一年期研究將使TD50降低4倍[（1年/2年）²=0.25]。需強(qiáng)調(diào)：此研究周期修正是TD50估算流程的既定環(huán)節(jié)，已常規(guī)應(yīng)用于致癌效力數(shù)據(jù)庫(kù)（CPDB）和Lhasa致癌性數(shù)據(jù)庫(kù)（LCDB）的TD50計(jì)算。
如此，公布的TD50值均折算為預(yù)期導(dǎo)致半數(shù)動(dòng)物因化學(xué)暴露患癌的終生每日暴露量，與其原始計(jì)算依據(jù)的實(shí)驗(yàn)方案無關(guān)。該特性對(duì)于評(píng)估非終身每日暴露于人群的場(chǎng)景時(shí)，如何應(yīng)用嚙齒動(dòng)物TD50推導(dǎo)的AIs具有重大意義。
1.6. 關(guān)于對(duì)亞硝胺采用AI限度時(shí)應(yīng)用LTL調(diào)整的考量
亞硝胺是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有N-亞硝基（R?N-N=O）官能團(tuán)的化合物。部分亞硝胺被列為已知人類致癌物，另一些則可能或很可能對(duì)人類具有致癌性（國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)，1978，2007）?，F(xiàn)有大量嚙齒動(dòng)物致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，涵蓋多種實(shí)驗(yàn)方案。與其他化學(xué)致癌物類似，其作用靶器官和效力受物種、給藥途徑等多種因素影響。最可靠的數(shù)據(jù)來自大鼠口服試驗(yàn)，其中肝臟和上消化道是亞硝胺最常見的靶器官。
亞硝胺的主要安全風(fēng)險(xiǎn)在于其屬于高效誘變致癌物類別（因含N-亞硝基亞結(jié)構(gòu)），在ICH M7(R2)指南中被稱為"關(guān)注隊(duì)列"（ICH，2023）。亞硝胺的致癌效力跨越數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，部分在嚙齒動(dòng)物中表現(xiàn)出強(qiáng)效致癌活性（Kroes等，2004；Snodin，2023；Thresher等，2020）。根據(jù)ICH M7建議，關(guān)注隊(duì)列化合物需單獨(dú)評(píng)估——即使攝入量低于1.5μg/天的TTC閾值，理論上仍存在顯著致癌風(fēng)險(xiǎn)，故應(yīng)采用個(gè)案分析法。
"關(guān)注隊(duì)列"術(shù)語由Kroes等（2004）首次提出，指代現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明TTC限度不足以為其提供充分保護(hù)的幾類致癌物（包括黃曲霉毒素和疊氮化合物）。Cheeseman等（1999）早期分析包含101種N-亞硝基化合物，Kroes補(bǔ)充了4種（但該數(shù)據(jù)集無法重建，Snodin 2023）。其中58種（55%）的致癌效力超過TTC限度（即TD??＜1.5mg/kg/天）。在101種N-亞硝基化合物中，65種為亞硝胺，其中44種（68%）在嚙齒動(dòng)物中的致癌效力超過ICH M7框架規(guī)定的TTC限度（1.5μg/天）。
根據(jù)ICH M7方法學(xué)分析的大量亞硝胺(NA)致癌性數(shù)據(jù)表明，其可接受攝入量(AI)限值低于毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)。因此，達(dá)到TTC的暴露水平將導(dǎo)致理論終生致癌風(fēng)險(xiǎn)超過十萬分之一（該風(fēng)險(xiǎn)水平被普遍認(rèn)可為藥品安全閾值）（ICH, 2023; Kroes等, 2004）。目前藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)（EMA, 2024; 美國(guó)FDA, 2021; 加拿大衛(wèi)生部, 2024）未對(duì)NA雜質(zhì)采用ICH M7指南中的長(zhǎng)期低劑量(LTL)調(diào)整因子設(shè)定AI限值。
唯一例外是歐洲藥品管理局(EMA)允許對(duì)CPCA分類1-4級(jí)的NA采取臨時(shí)限值：通過運(yùn)用ICH M7中最保守的兩項(xiàng)LTL調(diào)整因子，將AI限值提升至13.3倍（治療周期≤12個(gè)月）或6.7倍（治療周期＞12個(gè)月），但每日最大暴露量不超過1.5微克。該臨時(shí)限值適用于已上市產(chǎn)品，可在糾防措施(CAPA)實(shí)施期間（最長(zhǎng)達(dá)三年）使用（EMA, 2024）。
盡管如此，LTL調(diào)整對(duì)額外致癌風(fēng)險(xiǎn)的影響仍存不確定性，原因包括：某些NA化合物具有強(qiáng)致癌性、短期暴露即可誘發(fā)腫瘤、暴露增加可能超出DNA修復(fù)能力及引發(fā)毒性反應(yīng)（伴隨再生性細(xì)胞增殖）、以及多重用藥的影響。本文旨在探討NA嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)是否符合LTL框架基本原則（即致癌效力由最低致癌劑量決定，而非日劑量或劑量速率）。針對(duì)LTL方法適用性的其他質(zhì)疑，相關(guān)研究仍在持續(xù)進(jìn)行中。
2. 方法
2.1. 基于不同暴露周期的嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)識(shí)別亞硝胺
本研究雖聚焦于評(píng)估亞硝胺（NAs）的嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)，但將檢索范圍擴(kuò)展至Kroes等（2004）基于（潛在）高效性列入關(guān)注化合物（CoC）清單的其他物質(zhì)。通過Knime軟件（4.4.0版，www.knime.org）篩選Lhasa致癌性數(shù)據(jù)庫(kù)（LCDB）2024.1版數(shù)據(jù)，選定符合以下條件的CoC化合物：存在同一物種多種暴露周期記錄（排除含單次劑量實(shí)驗(yàn)的研究），包括N-亞硝基化合物（SMARTS NN=O）、烷基-氧化偶氮化合物（SMARTS [#6][N+]([O-])=N[#6]），以及通過雙呋喃亞結(jié)構(gòu)識(shí)別的黃曲霉毒素衍生物（SMARTS C12C(O[C,c]~[C,c]1)O[C,c]~[C,c]2，圖1）。
最終獲得18種亞硝胺化合物（其余N-亞硝基化合物經(jīng)人工剔除）和1種黃曲霉毒素（表2）。需說明，本文撰寫期間LCDB于2024年7月更新，部分TD50值因暴露周期調(diào)整發(fā)生變動(dòng)。經(jīng)核驗(yàn)，本研究涉及化合物的數(shù)值變化未影響最終結(jié)論。
2.2. 納入標(biāo)準(zhǔn)
對(duì)步驟1中識(shí)別出的具有不同給藥方式和/或研究時(shí)長(zhǎng)的嚙齒動(dòng)物致癌性數(shù)據(jù)的核苷酸類似物（NAs）進(jìn)行致癌性研究審查，評(píng)估其是否適用于LTL（長(zhǎng)期低劑量）分析。額外分析黃曲霉毒素B1，因其亦被視為CoC（致癌性關(guān)注）化合物（Kroes等，2004）。針對(duì)每種化合物評(píng)估LCDB（終身致癌性數(shù)據(jù)庫(kù)）中的致癌性數(shù)據(jù)，并比照LTL致癌性評(píng)估的納入標(biāo)準(zhǔn)。具體而言，判定化合物是否具備充分評(píng)估數(shù)據(jù)需滿足：通過相同暴露途徑，在相同物種、品系和性別的嚙齒動(dòng)物中獲取不同研究時(shí)長(zhǎng)的致癌性數(shù)據(jù)。最可靠的比較應(yīng)源于同一實(shí)驗(yàn)室的研究，且理想情況下需針對(duì)相同（最敏感）靶器官的腫瘤進(jìn)行比較。
我們認(rèn)為任何口服暴露（飲食、飲水、灌胃）均可用于其他口服研究的對(duì)比，但優(yōu)先采用相同給藥方式，因灌胃與其他口服給藥可能產(chǎn)生毒代動(dòng)力學(xué)差異。最后共識(shí)是：含單劑量組與對(duì)照組的試驗(yàn)可個(gè)案評(píng)估，因其仍可能提供定量或定性層面的有效信息。
各化合物由主評(píng)審員負(fù)責(zé)評(píng)估可用數(shù)據(jù)是否符合納入標(biāo)準(zhǔn)。主評(píng)審結(jié)論經(jīng)同行評(píng)審員或小型評(píng)審團(tuán)隊(duì)復(fù)核后，提交全體團(tuán)隊(duì)審議。最終形成關(guān)于該化合物數(shù)據(jù)可靠性分類的共識(shí)建議。共計(jì)九種化合物（八種NAs及黃曲霉毒素B1）的LCDB研究符合納入標(biāo)準(zhǔn)，其詳細(xì)分析見下文。另有三種NAs的數(shù)據(jù)部分滿足標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行定性評(píng)估。其余七種NAs因數(shù)據(jù)不足無法支持LTL評(píng)估。
3.結(jié)果
在LCDB中總共鑒定出18種NAs具有涉及多次暴露和/或研究持續(xù)時(shí)間的致癌性數(shù)據(jù)。18種NAs中有8種及黃曲霉毒素B1（另一種CoC致癌物）在LCDB中擁有符合納入標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)。NA案例研究均通過飲用水途徑進(jìn)行，而黃曲霉毒素B1則涉及飲食研究。我們注意到，在這些案例研究的出版物中，"劑量率"一詞通常用于指代整個(gè)暴露期間使用的飲用水濃度，如各案例所述。我們保留了"劑量率"這一術(shù)語，并沿用原始數(shù)據(jù)中報(bào)告的飲用水濃度值（而非以mg/kg bw/天表示的攝入量）。表2總結(jié)了這些案例研究的關(guān)鍵信息，后附各研究簡(jiǎn)要概述。盡管這些研究均發(fā)表于1970-1980年代，與現(xiàn)行指導(dǎo)方案相比存在局限性，但其設(shè)計(jì)常專門用于探究效價(jià)與日劑量/累積劑量等變量的關(guān)系，因而特別適用于本次評(píng)估.
3.1.符合納入標(biāo)準(zhǔn)的案例研究結(jié)果
3.1.1.N-亞硝基二乙胺
一項(xiàng)關(guān)于NDEA的致癌性研究在同一品系和性別的動(dòng)物中設(shè)置了不同暴露周期，符合納入標(biāo)準(zhǔn)。該研究(Lijinsky等,1981)中對(duì)雌性F344大鼠(20只/劑量組)通過飲用水每周給藥5天NDEA。暴露后動(dòng)物上消化道(食道、前胃、舌和口咽)腫瘤發(fā)生率顯著上升。暴露周期包括：17、22、30、60和104周，計(jì)劃總研究周期為130周。給藥濃度隨暴露周期變化如下：
1)17周暴露(113 mg/L)
2)22周暴露(45 mg/L)
3)30周暴露(0,0.45,1.1,2.8,7,18 mg/L)
4)60周暴露(0,0.45,1.1 mg/L)
5)104周暴露(0,0.45 mg/L)
原研究者發(fā)現(xiàn)≥7 mg/L劑量組存在顯著早期死亡現(xiàn)象，故排除這些數(shù)據(jù)。研究者計(jì)算的終生累積劑量(LCD)與給藥濃度、暴露周期及患瘤動(dòng)物數(shù)量如表3所示。剩余組數(shù)據(jù)顯示患瘤動(dòng)物比例與LCD呈明顯正相關(guān)(表3)，而非與給藥濃度或周期直接關(guān)聯(lián)。0.45 mg/L濃度在30/60/104周三個(gè)周期進(jìn)行測(cè)試，分別相當(dāng)于假定104周壽命的29%、58%和100%。暴露周期從30周(壽命29%)延長(zhǎng)至60周(壽命58%)時(shí)，腫瘤發(fā)生率增長(zhǎng)3倍(10%→30%)；全程暴露(100%壽命)較30周暴露腫瘤增加7倍，較60周暴露增加2.3倍。該結(jié)果符合c×t²·³=k的經(jīng)典方程(Druckrey,1967;Peto等,1984)，表明時(shí)間(t)對(duì)腫瘤發(fā)展的影響大于濃度(c)。
3.1.2. 二亞硝基高哌嗪
在LCDB數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到一項(xiàng)關(guān)于DNHP致癌性數(shù)據(jù)的研究。該研究在同一品系和性別的動(dòng)物中設(shè)置了不同暴露時(shí)長(zhǎng)，符合納入標(biāo)準(zhǔn)。該研究(Lijinsky等, 1982a)中，雌性F344大鼠(每組20只)通過飲水?dāng)z入DNHP。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上消化道(食道、前胃、舌、口咽和會(huì)厭)腫瘤發(fā)生率顯著上升。暴露周期包括30周、60周和120周，總研究周期計(jì)劃為133周。劑量率隨暴露時(shí)長(zhǎng)調(diào)整如下：1)30周暴露(0、1.1、2.8、7、18、44、110毫克/升)；2)60周暴露(0、7毫克/升)；3)120周暴露(0、1.1、2.8毫克/升)。原作者確定的LCD值及相應(yīng)劑量率、暴露時(shí)長(zhǎng)和患瘤動(dòng)物數(shù)量見表4。高劑量組動(dòng)物死亡率顯著高于對(duì)照組，最終影響研究周期。由于高劑量組死亡率過高，研究者在分析中剔除了這些組別。
其余組別數(shù)據(jù)表明，患瘤大鼠數(shù)量與累積劑量(LCD)呈明顯正相關(guān)，而非取決于劑量率或暴露時(shí)長(zhǎng)。如表4所示，相同劑量率(2.8毫克/升)暴露30周與120周相比，腫瘤發(fā)生率增長(zhǎng)4-5倍。換而言之，1.1毫克/升劑量暴露120周組有25%大鼠發(fā)生腫瘤，而2.8毫克/升(劑量率提高2.5倍)僅暴露30周組腫瘤發(fā)生率僅為20%。
3.1.3 N-亞硝基-1,2,3,6-四氫吡啶
在LCDB數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到一項(xiàng)關(guān)于NTHP的致癌性研究(Lijinsky等, 1982a)。該研究符合納入標(biāo)準(zhǔn)：NTHP以三種不同暴露時(shí)長(zhǎng)給予單一物種、品系和性別的動(dòng)物，且原始文獻(xiàn)提供了充分?jǐn)?shù)據(jù)以驗(yàn)證靶器官的荷瘤動(dòng)物數(shù)。
雌性F344大鼠通過飲水給予NTHP(每周5天；約20mL/鼠/日)，分為25周組(1, 2.6, 16, 40, 100 mg/L)、70周組(6.4 mg/L)和100周組(1, 2.6 mg/L)。未處理對(duì)照組與NTHP給藥組均飼養(yǎng)至自然死亡，或在瀕死狀態(tài)/研究結(jié)束時(shí)(約130周)實(shí)施安樂死。雖然25周組中16 mg/L(生存期=116周)、40 mg/L(生存期=52周)、100 mg/L(生存期=25周)以及70周組6.4 mg/L(生存期=100周)出現(xiàn)全因死亡率升高，但所有劑量組均在處死時(shí)記錄腫瘤發(fā)生率。上消化道腫瘤(乳頭狀瘤和/或癌)是最常見類型，包括食道、前胃、口咽及會(huì)厭部位腫瘤，因此該部位被視作評(píng)估腫瘤發(fā)生率與累積劑量(LCD)、劑量率和/或暴露時(shí)長(zhǎng)關(guān)系的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
如表5所示，本案例中腫瘤發(fā)生率與LCD未呈現(xiàn)嚴(yán)格相關(guān)性。但相同劑量率下延長(zhǎng)暴露時(shí)長(zhǎng)(對(duì)應(yīng)更高LCD)時(shí)，觀察到胃腸道腫瘤發(fā)生率升高(對(duì)比1.0 mg/L劑量率25周與100周、2.6 mg/L劑量率25周與100周、6.4 mg/L劑量率25周與70周數(shù)據(jù))。此外，在相似LCD下(45 mg與40 mg)，較低劑量率配合較長(zhǎng)暴露時(shí)間(6.4 mg/L持續(xù)70周 vs 16 mg/L持續(xù)25周)并未降低上消化道腫瘤發(fā)生率(分別為20/20與15/20)。
最后，較高劑量率(2.6 mg/L)短期暴露(25周)給予6.5 mg LCD時(shí)，相較于較低劑量率(1 mg/L)長(zhǎng)期暴露(100周)給予10 mg LCD，未觀察到胃腸道腫瘤發(fā)生率升高(分別為1/20與10/20)。
本案例中上消化道腫瘤發(fā)生率與總累積劑量無明確量效關(guān)系。但在相同劑量率(不同LCD)或相似LCD(不同劑量率)的給藥組間比較表明：雌性F344大鼠上消化道腫瘤發(fā)生率取決于LCD而非劑量率。該數(shù)據(jù)同時(shí)證實(shí)暴露時(shí)長(zhǎng)比日劑量影響更大，此規(guī)律與NDEA研究結(jié)論一致(見3.1.1節(jié))。
3.1.4. N-亞硝基七亞甲基亞胺（N-HEP）
Lijinsky等人（1982b）報(bào)道了一項(xiàng)在F344大鼠中進(jìn)行的N-HEP致癌性研究：20只雄性大鼠組分別通過飲用水?dāng)z入1-40 mg/L劑量的N-HEP，持續(xù)25、50或100周。另有雌雄動(dòng)物接受高劑量（100 mg/L）N-HEP及氘代N-HEP試驗(yàn)，但該部分因13周時(shí)出現(xiàn)顯著毒性而終止，故不納入本次總結(jié)。
N-HEP暴露組的上消化道（食管、前胃、舌及口咽部）腫瘤發(fā)生率升高。各暴露周期劑量如下：1）25周暴露期（0、6.40、16 mg/L）；2）50周暴露期（0、1、2.6、6.4 mg/L）；3）100周暴露期（0、1、2.6 mg/L）。終生累積劑量（LCD）、劑量率、暴露周期及患癌/乳頭狀瘤動(dòng)物數(shù)量/比例見表6。
>40 mg/L的劑量率導(dǎo)致過度毒性，數(shù)據(jù)未納入表格。≥16 mg的LCD使試驗(yàn)系統(tǒng)達(dá)到飽和（這些劑量組中≤75%動(dòng)物出現(xiàn)上消化道癌變或乳頭狀瘤）。在0-16 mg LCD的N-HEP處理組中，作者觀察到總劑量與癌/乳頭狀瘤發(fā)生率存在"明顯線性關(guān)系"，但劑量率或暴露周期無此相關(guān)性。
3.1.5. N-亞硝基嗎啉
一項(xiàng)關(guān)于NMOR（Lijinsky等，1988）在雌性Fischer 344大鼠中的致癌性研究符合納入標(biāo)準(zhǔn)。NMOR通過飲用水每周5天給予雌性Fischer 344大鼠。兩個(gè)最低劑量組各有100只動(dòng)物，80只動(dòng)物作為未處理對(duì)照組。六個(gè)中間劑量組每組96只大鼠，其中半數(shù)處理50周，半數(shù)處理100周。最高劑量組中，24只大鼠分別接受25、40或50周的NMOR處理。
從最低劑量組開始，隨著NMOR的終身累積劑量（LCD）增加，肝臟腫瘤（包括肝細(xì)胞腺瘤、肝細(xì)胞癌或血管肉瘤）發(fā)生率呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著上升趨勢(shì)。良性肝臟腫瘤主要出現(xiàn)在低劑量組，而高劑量組中惡性腫瘤發(fā)生率增加。數(shù)據(jù)顯示肝腫瘤發(fā)生率與LCD呈明顯線性相關(guān)（表7匯總）；死亡中位時(shí)間與總劑量間也存在類似關(guān)聯(lián)。尤其在中劑量組中，劑量率與腫瘤發(fā)生率明顯缺乏關(guān)聯(lián)——例如，給予0.45 mg/L處理100周的動(dòng)物（7/48只出現(xiàn)腫瘤）與給予1.1 mg/L處理50周的動(dòng)物反應(yīng)相同，再次凸顯LCD的關(guān)鍵作用。
3.1.6. N-亞硝基甲基-(2-苯乙基)胺
LCDB數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了一項(xiàng)關(guān)于NMPEA致癌性的研究(Lijinsky等,1982c)。該研究因在同一品系同性大鼠中設(shè)置了不同暴露時(shí)長(zhǎng)（含因受試物相關(guān)死亡導(dǎo)致的差異），符合納入標(biāo)準(zhǔn)。29只雄性F344大鼠（20只/劑量組）通過飲用水?dāng)z入NMPEA后，上消化道（食管、前胃、舌、口咽及鼻腔）腫瘤發(fā)生率顯著上升。所有劑量組設(shè)計(jì)暴露周期為33周，但最高兩個(gè)劑量組因嚴(yán)重毒性分別于30周和21周終止。增設(shè)的低劑量組暴露周期為104周。具體劑量安排：1)33周暴露組(0,0.4,1.1,3.2,9.5,28,115 mg/L)，其中28和115 mg/L組實(shí)際暴露21/30周；2)104周暴露組(0,0.4 mg/L)。停用后動(dòng)物自然死亡：低劑量組存活至約127周，9.5/28 mg/L組約42周，115 mg/L組約21周。
如表8所示，高劑量組動(dòng)物死亡率顯著高于對(duì)照組（如最高劑量組半數(shù)動(dòng)物2周內(nèi)死亡），直接影響研究周期。最高劑量組中存活動(dòng)物停用2周后恢復(fù)給藥，研究者認(rèn)為幸存動(dòng)物"消除了損傷源從而存活至腫瘤發(fā)生"。由于最高劑量組大量死亡，劑量與帶瘤死亡時(shí)間未呈現(xiàn)線性關(guān)系。原研究者排除三個(gè)高劑量組及104周組后，其余組在相同暴露周期內(nèi)呈現(xiàn)腫瘤發(fā)生率與終生致癌劑量(LCD)的劑量反應(yīng)關(guān)系（見表8非陰影行），且與劑量率變化一致。
其他組數(shù)據(jù)進(jìn)一步佐證該模式：在累積劑量相近（3.6 vs 4.1 mg）但劑量率（0.4 vs 1.1 mg/L）和周期（33 vs 104周）不同的條件下，上消化道腫瘤發(fā)生率均為50-55%。31和84 mg劑量組腫瘤發(fā)生率增至95%。最高劑量組總腫瘤發(fā)生率為45%，但半數(shù)動(dòng)物2周內(nèi)死亡，實(shí)際在存活至21周的動(dòng)物中發(fā)生率高達(dá)90%（9/10），與31/84 mg組相當(dāng)。
3.1.7 亞硝基二乙醇胺
三項(xiàng)不同的大鼠致癌性研究數(shù)據(jù)符合我們的納入標(biāo)準(zhǔn)。這些研究均采用相同品系（Fisher 344），雖測(cè)試了兩種性別（雄性和雌性），但實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)因設(shè)計(jì)或受試物相關(guān)死亡率而存在差異。表9匯總了這三項(xiàng)在Fischer 344大鼠中進(jìn)行的研究數(shù)據(jù)，對(duì)比了總給藥劑量與肝臟腫瘤發(fā)生率。三項(xiàng)經(jīng)口（飲水）途徑實(shí)施的F344大鼠研究暴露周期為45至100周，均在1984-1989年間由同一實(shí)驗(yàn)室發(fā)表，研究觀察到肝臟腫瘤（主要為肝細(xì)胞腫瘤伴膽管癌）發(fā)生率上升。
• Lijinsky等人（1984）將16-40只雄性和雌性F344大鼠分組暴露于含0、400、1000或2500 mg/L NDELA的飲用水中45-50周。另設(shè)一組暴露于400 mg/L濃度75周。主要研究中雌鼠日平均給藥劑量分別約為7.8、31.4和100 mg/kg/天，75周單劑量研究中雌鼠為14.4 mg/kg/天；雄鼠主要研究中約為6.02、16.8和48.4 mg/kg/天，75周單劑量研究為9.02 mg/kg/天?？倓┝浚↙CD）報(bào)告為0、2、3、5和11 g/鼠。雌鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生率：對(duì)照組0/40，低劑量組15/16，中低劑量組16/16，中高劑量組19/20，高劑量組20/20；雄鼠發(fā)生率：對(duì)照組1/40，低劑量組14/16，中低劑量組14/16，中高劑量組18/20，高劑量組20/20。
• Lijinsky & Kovatch（1985）將20-39只雌雄F344大鼠分組暴露于含0、28、64和160 mg/L NDELA的飲用水：低濃度組暴露100周，高濃度組50周，中濃度組分別暴露50周和100周。雌鼠日平均給藥劑量約879、1000、2010和2510 mg/kg/天，雄鼠約640、795、1460和1830 mg/kg/天。平均總劑量（LCD）報(bào)告為0、280、320、640和800 mg/鼠。雌鼠總肝腫瘤（肝細(xì)胞癌/新生結(jié)節(jié)/膽管細(xì)胞癌或腺瘤）發(fā)生率：對(duì)照組1/20，低劑量組10/39，中低劑量組5/20，中高劑量組14/20，高劑量組27/27；雄鼠發(fā)生率：對(duì)照組4/20，低劑量組6/39，中低劑量組2/20，中高劑量組11/20，高劑量組19/27。
• Hecht等人（1989）將每組20只雌性F344大鼠暴露于含0或150 mg/L NDELA的飲用水50周。NDELA日平均劑量相當(dāng)于0和2560 μg/kg/天；50周總劑量為750 mg。肝細(xì)胞腫瘤發(fā)生率：對(duì)照組0/20，NDELA組14/20。
3.1.8. N-亞硝基吡咯烷在LCDB中關(guān)于NPYR的13個(gè)致癌性數(shù)據(jù)集中，有兩項(xiàng)研究被確定符合我們的納入標(biāo)準(zhǔn)，這些研究涉及相同的物種、品系、性別和暴露途徑，但暴露時(shí)間和/或研究持續(xù)時(shí)間不同。在Hoos等人（1985年）的研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠（每組80只）通過飲用水?dāng)z入相同總量NPYR（600 mg/kg），但給藥持續(xù)時(shí)間和間隔不同。具體而言，一組大鼠以1 mg/kg/天的劑量連續(xù)處理600天并在剩余壽命期接受觀察；另一組以2 mg/kg/天的劑量處理300天并在剩余壽命期接受觀察。在Berger等人（1987年）的研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠（每組80只）通過飲用水途徑分別以0.04、0.133和0.4 mg/kg/天的劑量攝入NPYR，持續(xù)641-680天。雖然該研究因持續(xù)時(shí)間無變化而無法單獨(dú)評(píng)估LTL，但其通過引入較低劑量豐富了整體數(shù)據(jù)集，展示了該化合物良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系。與載體對(duì)照組相比，兩項(xiàng)研究均觀察到腫瘤發(fā)生率升高，其中肝臟是最敏感器官。
表10匯總了研究者確定的終生累積劑量、劑量率、暴露持續(xù)時(shí)間和患腫瘤動(dòng)物數(shù)量。正如預(yù)期，Berger等人（1987年）報(bào)告的低劑量組數(shù)據(jù)顯示LCD與劑量率呈近似線性相關(guān)，因這些劑量組的暴露持續(xù)時(shí)間差異極小。在Hoos等人（1985年）涉及不同暴露持續(xù)時(shí)間的兩個(gè)高劑量組中，腫瘤發(fā)生率與終生累積劑量的關(guān)聯(lián)更密切。盡管300天2 mg/kg/天劑量組的腫瘤發(fā)生率（76%）略高于600天1 mg/kg/天劑量組（66%），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Hoos等，1985）。
3.2. 北美案例研究結(jié)果摘要
八個(gè)北美案例研究的數(shù)據(jù)均支持以下結(jié)論：LCD（終生累積劑量）是評(píng)估腫瘤結(jié)局最合適的劑量指標(biāo)，因此也是評(píng)估致癌效力的最佳依據(jù)。圖2以圖示形式展示了其中四項(xiàng)案例研究，清晰揭示了這種關(guān)聯(lián)。盡管所有八項(xiàng)研究都證實(shí)了LCD與腫瘤結(jié)局的關(guān)系，但部分?jǐn)?shù)據(jù)集建模因短期高劑量給藥導(dǎo)致的早期死亡（進(jìn)而降低腫瘤發(fā)生率）而復(fù)雜化。
多數(shù)數(shù)據(jù)集的建模難點(diǎn)在于劑量反應(yīng)在LCD達(dá)到約80%動(dòng)物患瘤率后呈現(xiàn)自然平臺(tái)期。如下文NMOR案例所示，最高兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（終生累積劑量160 mg和250 mg）未予展示，因腫瘤發(fā)生率已穩(wěn)定在90%以上。平臺(tái)效應(yīng)在其他案例中同樣存在，導(dǎo)致數(shù)據(jù)呈指數(shù)擬合趨勢(shì)；但通過直觀觀察可見，在較低LCD區(qū)間內(nèi)腫瘤發(fā)生率與LCD基本呈線性關(guān)系。
所有八項(xiàng)研究均采用大鼠飲用水暴露實(shí)驗(yàn)，持續(xù)時(shí)間21至120周不等。其中七項(xiàng)使用F344大鼠：三項(xiàng)雄性、三項(xiàng)雌性、一項(xiàng)兩性數(shù)據(jù)。第八項(xiàng)研究（NPYR）采用雄性Sprague-Dawley大鼠。值得注意的是：五項(xiàng)研究包含≤30周的致癌性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，八項(xiàng)均包含終生生物測(cè)定等效數(shù)據(jù)（98-120周）。多組不同周期研究由相同團(tuán)隊(duì)發(fā)表，因其他變量（如物種品系、性別年齡、暴露途徑、基礎(chǔ)飲食、實(shí)驗(yàn)室條件）恒定，成為理想對(duì)比樣本。
主要靶器官包括上消化道（食道、前胃、舌、口咽）及肝臟腫瘤。這些案例清晰表明LCD與致癌效力的關(guān)聯(lián)：多個(gè)研究顯示在相似LCD下，無論劑量率或暴露時(shí)長(zhǎng)差異，腫瘤結(jié)局均趨同。由此推論，在固定劑量率不同時(shí)長(zhǎng)的研究中，暴露時(shí)長(zhǎng)與腫瘤結(jié)局的關(guān)系同樣明確——這最終反映與LCD的關(guān)聯(lián)。例如：飲用水中0.45 mg/L NDEA暴露30周、60周、104周后，大鼠腫瘤發(fā)生率分別為2/20、6/20、14/20。
需指出：盡管LCD被確定為最適用劑量指標(biāo)，但部分案例（NDEA、NTHP）同時(shí)揭示暴露時(shí)長(zhǎng)對(duì)腫瘤結(jié)局的影響遠(yuǎn)超劑量率。以0.45 mg/L NDEA為例，暴露時(shí)長(zhǎng)從30周增至104周（3.5倍增幅）導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率提升7倍。Peto等（1991）針對(duì)NDEA的給藥時(shí)長(zhǎng)失衡效應(yīng)已作詳細(xì)探討（見章節(jié)3.1.1）。
3.3. 其他明確致癌物：黃曲霉毒素B1除亞硝胺案例研究外，我們還獲取了涉及不同暴露時(shí)長(zhǎng)的黃曲霉毒素B1（AFB1，CAS# 1162-65-8）嚙齒動(dòng)物致癌性數(shù)據(jù)。終身致癌數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄25項(xiàng)研究，涵蓋五種物種（食蟹猴、恒河猴、小鼠、大鼠及樹鼩），涉及三種給藥途徑（膳食、管飼、腹腔注射）。但僅雄性F344大鼠數(shù)據(jù)符合納入標(biāo)準(zhǔn)，具體如下。
雄性F344大鼠的三項(xiàng)膳食研究表明肝癌發(fā)生率升高（多數(shù)研究描述為肝細(xì)胞癌，其中一項(xiàng)稱為肝癌）（Nixon等，1974，1981；Wogan等，1974）。這些研究的暴露周期為52至104周；其中兩項(xiàng)出自同一實(shí)驗(yàn)室但發(fā)表年份相隔甚遠(yuǎn)。表11匯總了這三項(xiàng)膳食研究數(shù)據(jù)。最具啟發(fā)性的是Nixon等（1974，1981）的研究：大鼠通過膳食分別暴露于20ppb（104周）或50ppb（52周），終生累積劑量相近。兩組的腫瘤發(fā)生率幾乎相同（40% vs 38%），這支持了終生累積劑量比劑量率更適合作為劑量指標(biāo)的假說。
需說明的是，雄性F344大鼠管飼研究采用極短期給藥（2-8周）（Wogan等，1971）。但該研究使用極高管飼劑量（25–70μg/次），多數(shù)劑量組出現(xiàn)100%腫瘤發(fā)生率，故無法用于定量評(píng)估。值得注意的是，這些大鼠的總給藥劑量達(dá)1000至3000μg/kg/日，與導(dǎo)致80–100%腫瘤發(fā)生率的慢性劑量范圍重疊，該結(jié)果與基于終生累積劑量指標(biāo)的預(yù)期一致。
如表11所示，多數(shù)AFB1數(shù)據(jù)涉及慢性暴露（≥95周）。同一實(shí)驗(yàn)室的50ppb（52周）與20ppb（104周）給藥研究（均于104周終止）顯示完全一致的腫瘤反應(yīng)，證實(shí)了終生累積劑量是評(píng)估致癌效能的合理指標(biāo)。終身致癌數(shù)據(jù)庫(kù)中的TD50值（經(jīng)1.5節(jié)所述研究時(shí)長(zhǎng)校正）也佐證了該結(jié)論——膳食50ppb（52周）與20ppb（104周）的TD50值極為接近（分別為0.00134 mg/kg/日與0.00113 mg/kg/日）。
3.4. 部分符合納入標(biāo)準(zhǔn)的案例研究除上述案例研究外，還有三個(gè)國(guó)家評(píng)估報(bào)告的數(shù)據(jù)部分符合我們的納入標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行定性評(píng)估：4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、4-(丁基亞硝胺基)-1-丁醇和N-亞硝基-雙(2-氧丙基)胺。盡管針對(duì)每種化合物都有大量研究，但數(shù)據(jù)存在局限性，無法對(duì)累積劑量與致瘤反應(yīng)進(jìn)行完整的定量比較。
然而，我們發(fā)現(xiàn)這些案例對(duì)定性評(píng)估具有參考價(jià)值，可增強(qiáng)線性閾值假說(LTL)的證據(jù)權(quán)重。三項(xiàng)案例研究均進(jìn)一步支持了"累積終生劑量(LCD)是評(píng)估致瘤反應(yīng)的合適劑量指標(biāo)"這一假說；重要的是，沒有任何數(shù)據(jù)引發(fā)質(zhì)疑。•煙草源性致癌物4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（更常稱為NNK，CAS RN 64091-91-4）在LCDB數(shù)據(jù)庫(kù)中有12項(xiàng)研究。這些研究通過皮下注射、氣管內(nèi)給藥、頰囊給藥或飲用水給藥途徑在大鼠或倉(cāng)鼠中進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間從單次給藥到終生暴露不等，由不同研究團(tuán)隊(duì)完成。
但這些研究的實(shí)用性有限：主要是單次劑量研究、采用非標(biāo)準(zhǔn)給藥途徑，且使用懷孕倉(cāng)鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Hoffmann等(1981)的研究具有一定定性參考價(jià)值：當(dāng)相同終生累積劑量（約190 mg）以兩種不同劑量率/處理時(shí)長(zhǎng)（25周內(nèi)75次×2.5 mg/劑量 vs 6.3周內(nèi)19次×10 mg/劑量）施用于敘利亞倉(cāng)鼠時(shí)，雌性倉(cāng)鼠的肺部及整體呼吸道腫瘤發(fā)生率相近。但雄性倉(cāng)鼠在25周暴露期（每周3次×2.5 mg/劑量）比6.3周暴露期（每周3次×10 mg/劑量）出現(xiàn)更多腫瘤（肺/呼吸道腫瘤發(fā)生率100% vs 53-67%）。
研究者認(rèn)為25周組腫瘤發(fā)生率升高可能與動(dòng)物生存期延長(zhǎng)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明：相同總劑量（190 mg）在6.3周與25周暴露期產(chǎn)生的腫瘤效應(yīng)基本相當(dāng)；或因生存期差異，壓縮至短暴露期（6.3周）可能降低致瘤效力。•LCDB數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于4-(丁基亞硝胺基)-1-丁醇（BBN）的7項(xiàng)研究存在局限性：部分劑量過高導(dǎo)致100%致瘤反應(yīng)；部分因早期死亡中斷；暴露時(shí)長(zhǎng)不一或不明；使用不同大鼠品系/亞系。
盡管如此，明確劑量反應(yīng)關(guān)系仍驗(yàn)證了LCD對(duì)膀胱腫瘤數(shù)量的重要性：不同實(shí)驗(yàn)室使用各亞系大鼠（暴露期39-106周），總累積劑量0/17/75/86.5/128/408 mg分別引發(fā)0/0/20/67/77/100%的膀胱腫瘤發(fā)生率。•N-亞硝基-雙(2-氧丙基)胺（CAS RN 60599-38-4）的7項(xiàng)研究因大鼠品系和給藥途徑差異引入變異性，適合定性而非定量分析。例如Lijinsky實(shí)驗(yàn)室兩項(xiàng)研究（雌性F344大鼠）：灌胃法（30周暴露/終生觀察）與飲用水法（50周暴露/75周觀察）顯示累積劑量158 mg與275 mg時(shí)，肝細(xì)胞癌發(fā)生率呈明確劑量依賴性（42% vs 60%），印證累積劑量的關(guān)鍵作用(Lijinsky等, 1984; Lijinsky & Reuber, 1983)。
4. 討論本次評(píng)估
通過嚙齒類動(dòng)物致癌性研究提供實(shí)證依據(jù)，證實(shí)亞硝胺化合物（NAs）的致癌效力取決于總暴露劑量而非日劑量。這是ICH M7指南評(píng)估藥物中致突變雜質(zhì)終生暴露（LTL）的核心原則。需要指出的是，本文涉及的八例亞硝胺案例均屬低分子量亞硝胺，其結(jié)構(gòu)無法代表原料藥中復(fù)雜的大分子亞硝胺雜質(zhì)。多數(shù)藥物相關(guān)亞硝胺雜質(zhì)近期才被發(fā)現(xiàn)，因此缺乏傳統(tǒng)嚙齒動(dòng)物致癌性數(shù)據(jù)來支持以劑量率或終生累積劑量（LCD）作為效力關(guān)鍵決定因素的論證（Schlingemann等2023）。
但鑒于八項(xiàng)案例涵蓋現(xiàn)有數(shù)據(jù)中最強(qiáng)效的亞硝胺，本次分析可視為"最壞情境"推演，其結(jié)果可外推至藥物相關(guān)亞硝胺的化學(xué)空間。本研究所涉亞硝胺效力跨度極大——從高效力物質(zhì)（如NMPEA，可接受攝入量AI=8ng/天；NDEA，AI=26.5ng/天）²至超越毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）物質(zhì)（如NPYR，AI=1700ng/天；NDELA，AI=1900ng/天）³，每項(xiàng)案例均實(shí)證了以終生累積劑量作為癌癥效力基準(zhǔn)的LTL原則。
基于此及對(duì)更廣泛化學(xué)空間LTL數(shù)據(jù)的評(píng)估（Felter等，2011），原料藥相關(guān)復(fù)雜亞硝胺很可能同樣遵循LTL原則。除八項(xiàng)涉及不同暴露時(shí)長(zhǎng)/研究周期的亞硝胺案例外，黃曲霉毒素B1（另一遺傳毒性致癌物）的案例研究進(jìn)一步佐證該原則適用于具有致突變作用機(jī)制的高效致癌物。值得注意的是，多數(shù)原始研究作者在呈現(xiàn)數(shù)據(jù)時(shí)已基于累積劑量關(guān)系進(jìn)行整理。關(guān)鍵的是，當(dāng)前沒有任何定量或定性數(shù)據(jù)對(duì)LTL原則的適用性提出質(zhì)疑。
盡管這八項(xiàng)案例研究?jī)H涵蓋亞硝胺類化合物廣闊化學(xué)空間中的有限樣本，但其作為現(xiàn)有最完善的數(shù)據(jù)集，囊括了不同致癌強(qiáng)度等級(jí)（后續(xù)將展開討論）。值得注意的是，作為一類特殊化合物，亞硝胺擁有較其他化學(xué)品類更豐富的嚙齒類動(dòng)物致癌性數(shù)據(jù)，這些研究采用不同暴露周期和/或?qū)嶒?yàn)時(shí)長(zhǎng)的方案。
這既因公共衛(wèi)生界早在1950年代（遠(yuǎn)早于標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)程建立之時(shí)）就已關(guān)注亞硝胺風(fēng)險(xiǎn)，也因多種亞硝胺化合物被用作化學(xué)致癌基礎(chǔ)研究的模型物質(zhì)（包括給藥方案與實(shí)驗(yàn)周期的影響）。因此，多數(shù)評(píng)估暴露周期與/或?qū)嶒?yàn)時(shí)長(zhǎng)影響的亞硝胺嚙齒動(dòng)物致癌研究由相同團(tuán)隊(duì)完成，從而在排除其他致癌強(qiáng)度干擾變量的條件下實(shí)現(xiàn)了嚴(yán)謹(jǐn)對(duì)比。但需指出，大量現(xiàn)有研究未必能為"累積劑量是否最適用作劑量指標(biāo)"的評(píng)估提供有效依據(jù)。令人意外的是，盡管NDMA（N-亞硝基二甲胺）擁有大量研究數(shù)據(jù)（致癌性數(shù)據(jù)庫(kù)收錄22項(xiàng)），卻無一項(xiàng)符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)。
鑒于ICH M7指南中致突變雜質(zhì)的可接受攝入量（AIs）基于TD50值設(shè)定，我們簡(jiǎn)述了TD50的計(jì)算方法，特別是針對(duì)非終身每日給藥、實(shí)驗(yàn)周期短于或長(zhǎng)于標(biāo)準(zhǔn)兩年致癌實(shí)驗(yàn)的嚙齒動(dòng)物研究如何進(jìn)行定量調(diào)整（參見第1.5節(jié)）。這些調(diào)整最終確定的AI值旨在確保終身每日暴露的理論風(fēng)險(xiǎn)不超過十萬分之一?？紤]到人類暴露時(shí)長(zhǎng)存在短期至慢性的巨大差異，ICH M7指南（2023）提出了短期暴露下的AI限值上調(diào)方法——通過隨暴露周期遞減而遞增的安全系數(shù)實(shí)現(xiàn)。
在比較不同持續(xù)時(shí)間的嚙齒動(dòng)物致癌性數(shù)據(jù)以評(píng)估給藥/研究時(shí)長(zhǎng)的影響時(shí)，可參考已發(fā)表的TD50值。黃曲霉毒素B1的案例顯示：52周50 ppb飲食給藥與104周20 ppb飲食給藥的TD50值高度接近（分別為0.00134 mg/kg/天和0.00113 mg/kg/天）。但我們發(fā)現(xiàn)更有價(jià)值的是分析各案例的實(shí)際腫瘤發(fā)生率數(shù)據(jù)，評(píng)估LCD（最低致癌劑量）與腫瘤結(jié)局的關(guān)系——這正是LTL（終生暴露極限）概念的基礎(chǔ)。
本文研究的8個(gè)遺傳毒性致癌物（NA）案例覆蓋21至120周的研究時(shí)長(zhǎng)，涵蓋短至標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物壽命5%的給藥場(chǎng)景。某些超短期給藥研究因高劑量導(dǎo)致過早死亡而被排除，因其無法定量評(píng)估致癌效力。黃曲霉毒素B1案例與8個(gè)NA案例共同代表了廣泛的效力范圍（黃曲霉毒素B1效力最強(qiáng)），覆蓋CPCA第1-4類別及現(xiàn)有基于化合物特異性致癌數(shù)據(jù)的監(jiān)管AI值。
盡管這些案例強(qiáng)有力證實(shí)LCD是NA的合適劑量指標(biāo)（黃曲霉毒素B1數(shù)據(jù)表明該原則同樣適用于高效致癌物），但監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)ICH M7指南中LTL調(diào)整因子應(yīng)用于藥物NA雜質(zhì)的適用性仍存疑慮，主要包括：
• 單次暴露誘發(fā)腫瘤的研究評(píng)估（主要采用新生小鼠模型）
• 允許終生劑量壓縮至超短周期時(shí)潛在DNA修復(fù)超載風(fēng)險(xiǎn)
• 多重用藥導(dǎo)致的暴露量增加風(fēng)險(xiǎn)
• 支持ICH M7指南特定LTL調(diào)整因子及治療時(shí)長(zhǎng)分類應(yīng)用于NA雜質(zhì)的數(shù)據(jù)充分性
此外，需評(píng)估慢性間歇性暴露是否符合ICH M7指南的LTL原則（即允許攝入量應(yīng)以總給藥天數(shù)而非給藥時(shí)間間隔為基準(zhǔn)，且給藥天數(shù)需關(guān)聯(lián)相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)類別）。我們將持續(xù)研究間歇性暴露的其他評(píng)估方法，以完善ICH M7指南對(duì)NA雜質(zhì)的適用性。
5. 總結(jié)與結(jié)論
本文探討了關(guān)于ICH M7指南中LTL暴露于藥品NA雜質(zhì)適用性的核心問題——是否存在可參照LTL概念基礎(chǔ)前提評(píng)估的NA致癌性數(shù)據(jù)：即致癌效力取決于總暴露量而非日劑量。為解答該問題，本研究從LCDB數(shù)據(jù)庫(kù)中提取了涉及不同暴露時(shí)長(zhǎng)/研究周期的NA嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)，并依據(jù)合著者共識(shí)制定的納入標(biāo)準(zhǔn)（要求致癌數(shù)據(jù)來自同物種、品系、性別及暴露途徑，最可靠對(duì)比需源于同一實(shí)驗(yàn)室且針對(duì)相同靶器官）進(jìn)行評(píng)估。
針對(duì)八項(xiàng)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的NA案例研究進(jìn)行了嚴(yán)格評(píng)估；同時(shí)納入另一種高效力致癌物黃曲霉毒素B1的數(shù)據(jù)。案例研究涵蓋廣泛效力范圍的NA及21至120周的研究周期。所有案例均發(fā)現(xiàn)致癌效力與動(dòng)物接受的總劑量相關(guān)，與日劑量或劑量率無關(guān)——這直接回應(yīng)了關(guān)于ICH M7方法處理LTL暴露適用性的關(guān)鍵問題。值得注意的是，現(xiàn)有數(shù)據(jù)（定性與定量）均未對(duì)LTL原則的適用性提出質(zhì)疑。
盡管基礎(chǔ)問題已通過實(shí)證數(shù)據(jù)得到解答，但在NA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中應(yīng)用LTL原則仍需解決若干問題以達(dá)成共識(shí)：包括單劑量NA致癌研究、多藥并用考慮、LTL較高限度是否可能導(dǎo)致超出DNA修復(fù)/解毒機(jī)制的暴露水平，以及現(xiàn)有ICH M7指南中LTL分級(jí)（表1）的適用性依據(jù)。這些持續(xù)研究領(lǐng)域?qū)⒘硇邪l(fā)表，最終為ICH M7亞工作組（近期成立以制定《亞硝胺雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與控制》附錄，補(bǔ)充《DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)評(píng)估與控制指南》）提供科學(xué)支持，旨在完善亞硝胺雜質(zhì)安全評(píng)估及控制標(biāo)準(zhǔn)建立工作。
來源：文亮頻道
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