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摘 要： 建立了頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定六堡茶中5種特征香味物質(zhì)的分析方法。在頂空瓶中加入 0.1 g 粉碎茶葉，依次加入 3 g 氯化鈉、10.0 mL 超純水及2-異丁基-3-甲氧基吡嗪內(nèi)標(biāo)溶液；用 DVB/PDMS 萃取纖維在 60 ℃條件下萃取 40 min，于 250 ℃進(jìn)樣口解析3 min進(jìn)樣；用 HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進(jìn)行程序升溫分離，質(zhì)譜檢測(cè)采用選擇離子模式。5種特征香味物質(zhì)質(zhì)量濃度在10～500 ng/L范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.997，方法檢出限為0.2～0.9 µg/kg。5種目標(biāo)化合物在實(shí)際樣品中加標(biāo)平均回收率為86.0%～103%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～9.9%（n=6）。頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，萃取、濃縮、自動(dòng)進(jìn)樣高度集成，為方便推廣和用于其他類型茶葉的香氣篩查和定量分析提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞： 頂空固相微萃取； 六堡茶； 特征香味物質(zhì)； 氣相色譜-質(zhì)譜法

 

六堡茶是廣西名茶、邊銷茶，原產(chǎn)于廣西梧州六堡鎮(zhèn)，具有1 500多年歷史，以“紅、濃、陳、醇”的獨(dú)特品質(zhì)深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)，在相關(guān)政策[1]支持下，六堡茶產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)快速發(fā)展的態(tài)勢(shì)[2]。

作為黑茶類產(chǎn)品，六堡茶具有黑茶特有的風(fēng)味與滋味，其加工以鮮葉為原料，需經(jīng)歷冷水渥堆發(fā)酵、陳化等特殊工藝[3]。在長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵和陳化過(guò)程中，六堡茶產(chǎn)生大量不同揮發(fā)性化合物，這些化合物組合形成的特殊香氣是影響消費(fèi)者選擇的重要因素[4]。這些特殊的香氣成分主要包括芳香烴類、醇類、酮類、醛類、烯類、雜氧化合物和酯類7類[5]，具體化合物主要有α-紫羅酮、 β-紫羅酮、雪松醇、水楊酸甲酯、芳樟醇等[6?7]。

筆者結(jié)合現(xiàn)有研究成果和前期篩查[5?7]，確定芳樟醇、薄荷腦、香葉醇、 β-紫羅蘭酮、雪松醇5種含量較高的物質(zhì)為六堡茶特征香味物質(zhì)。目前所報(bào)道的化合物定量方法多采用面積歸一化法，而面積歸一化法是根據(jù)各成分峰面積占總峰面積的比例來(lái)計(jì)算各成分的相對(duì)含量[8?9]，存在明顯局限性：其一，該方法要求所有成分均能出峰并且被檢測(cè)到，否則會(huì)導(dǎo)致計(jì)算的各成分含量高于實(shí)際值，尤其對(duì)含量較低的成分，相對(duì)誤差更大；其二，該方法忽略不同化合物的響應(yīng)因子差異，默認(rèn)所有組分的檢測(cè)響應(yīng)相同。通過(guò)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白基質(zhì)中相同濃度的芳樟醇、薄荷腦、香葉醇、 β-紫羅蘭酮、雪松醇5種特征化合物質(zhì)譜峰面積響應(yīng)值比例為8∶6∶1∶2∶12，其中雪松醇和香葉醇響應(yīng)差異超過(guò)10倍，而面積歸一化法無(wú)法校正此類差異，導(dǎo)致定量準(zhǔn)確度遠(yuǎn)低于外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法，因此有必要對(duì)特征香氣成分建立獨(dú)立校準(zhǔn)曲線。筆者創(chuàng)新性引入2-異丁基-3-甲氧基吡嗪作為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法可有效抵消儀器波動(dòng)、進(jìn)樣誤差及樣品處理?yè)p失的影響，尤其適用于茶葉這類基質(zhì)復(fù)雜的樣品。

在茶葉香味化合物的檢測(cè)分析中，常用儀器包括氣相色譜儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[10?11]等。而在揮發(fā)性香味物質(zhì)的提取環(huán)節(jié)，同時(shí)蒸餾萃取法與溶劑萃取法是最為常見的兩種方法，二者雖能有效提高檢測(cè)方法的靈敏度，且具有較好的重現(xiàn)性，但存在明顯不足：提取時(shí)間較長(zhǎng)、操作流程繁瑣，且需使用大量有機(jī)溶劑，這些溶劑通常難以完全去除，易殘留在提取物中。大量的有機(jī)溶劑對(duì)操作人員的健康有潛在危害，而且使用后的溶劑若處理不當(dāng)，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，因此對(duì)綠色環(huán)保的樣品處理方法需求非常急迫。

氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）法是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的無(wú)損檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)κ称芳捌浼庸み^(guò)程樣品的香氣品質(zhì)進(jìn)行判斷。覃榕珍等[12]采用GC-IMS技術(shù)對(duì)不同烘焙溫度對(duì)六堡茶香氣品質(zhì)的影響，茶樣稱取質(zhì)量為1 g，在80 ℃下孵化15 min后進(jìn)樣分析。頂空-固相微萃取(HS-SPME)以涂漬在石英玻璃纖維上的高分子涂層固定相作為吸附介質(zhì)，對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行萃取和濃縮，并通過(guò)氣相色譜儀進(jìn)樣口進(jìn)行分析，是集萃取、濃縮、解吸、進(jìn)樣于一體的樣品處理新技術(shù)。該技術(shù)幾乎不需要有機(jī)溶劑，避免了溶劑污染和廢液處理問(wèn)題，符合綠色化學(xué)原則。溫立香等[13]采用頂空-固相微萃取法結(jié)合GC-MS法分析陳香六堡茶品質(zhì)特征香氣成分，茶葉取樣質(zhì)量為6 g，質(zhì)譜掃描方式為全掃描，以NIST質(zhì)譜庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行定性，各組分含量按峰面積歸一化法計(jì)算。朱曉鳳等[14]分別采用同時(shí)蒸餾萃取法（SDE）和頂空-固相微萃取法（HS-SPME）兩種方法提取霍山黃大茶中的香氣成分，SDE法茶葉稱樣質(zhì)量為20 g，回流萃取1.5 h，需要30?mL無(wú)水乙醚萃取收集。HS-SPME法茶葉稱樣質(zhì)量為3 g，加入30 mL的100 ℃飽和氯化鈉溶液，沖泡5 min后，80 ℃水浴吸附60?min，取出待測(cè)，質(zhì)譜掃描方式為全掃描，定性和定量方法與文獻(xiàn)[13]基本一致。相對(duì)于需要大量樣品和溶劑的傳統(tǒng)提取分析方法，很多領(lǐng)域的樣品處理和分析均傾向于采用頂空-固相微萃取技術(shù)[15?16]，茶葉香氣成分以及風(fēng)味物質(zhì)的研究也越來(lái)越多采用該技術(shù)[17?18]。需注意的是，茶葉樣品基質(zhì)成分復(fù)雜，不同檢測(cè)技術(shù)及參數(shù)對(duì)分析結(jié)果影響較大：文獻(xiàn)[12]采用氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）技術(shù)，該技術(shù)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品的抗干擾能力較弱，僅通過(guò)軟件內(nèi)置的NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)與 IMS 遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析，且針對(duì)已定性成分僅基于峰體積值計(jì)算相對(duì)含量，其定性與定量準(zhǔn)確性均不足，仍需依賴標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步準(zhǔn)確定性與定量；而文獻(xiàn)[13]與文獻(xiàn)[14]雖均采用頂空-固相微萃取技術(shù)，且質(zhì)譜檢測(cè)均為全掃描方式，但是在茶葉樣品取樣質(zhì)量上存在差異，分別為6 g與3 g。

筆者采用的是質(zhì)譜選擇離子模式，僅采集特定離子，減少基質(zhì)干擾，靈敏度大幅提高，樣品取樣質(zhì)量?jī)H為0.1 g。相對(duì)于依靠NIST質(zhì)譜庫(kù)定性和面積歸一化法定量，該實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間、定性離子豐度比等更為準(zhǔn)確的定性方法；定量方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物同步經(jīng)歷萃取、在進(jìn)樣口解析等步驟，可避免吸附損失等造成的測(cè)定值偏差，更好地消除了進(jìn)樣波動(dòng)，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、鹽析效應(yīng)等多個(gè)頂空-固相微萃取關(guān)鍵因素[19]的優(yōu)化，最終建立了以內(nèi)標(biāo)法為定量方法的六堡茶中芳樟醇、薄荷腦、香葉醇、β-紫羅蘭酮和雪松醇5種特征香氣成分化合物頂空固相微萃取檢測(cè)分析方法，該方法不僅樣品用量少，較傳統(tǒng)溶劑提取檢出限降低1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)靈敏度顯著提升；有機(jī)溶劑用量?jī)H為 20 μL 內(nèi)標(biāo)使用溶液，在減少溶劑污染、契合綠色化學(xué)原則方面實(shí)現(xiàn)環(huán)保性突破。該方法的建立為六堡茶香氣品質(zhì)的數(shù)字化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了方法學(xué)基礎(chǔ)，解決了傳統(tǒng)研究因定量偏差導(dǎo)致的香氣貢獻(xiàn)度誤判問(wèn)題，為六堡茶香氣品質(zhì)調(diào)控和的加工技術(shù)提升提供技術(shù)支持。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-TQ8050 NX型，配備AOC-6000 Plus多功能進(jìn)樣器（包括液體進(jìn)樣、頂空進(jìn)樣和SPME進(jìn)樣模式），島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

固相微萃取纖維：聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚丙烯酸酯(PA)、二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)及碳寬范圍(WR/PDMS)，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

超純水儀：Labonova Smart型，思柯萊博（上海）生命科學(xué)有限公司。

數(shù)字顯示天秤：ML104/02型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

螺紋口頂空樣品瓶：18 mm，含PTFE/藍(lán)色硅膠隔墊磁性金屬蓋，德國(guó)CNW公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

氯化鈉，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

芳樟醇、薄荷腦、香葉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為100 mg/L，批號(hào)分別為1ST 3303、1ST 40117、1ST 3306，天津阿爾塔科技有限公司 。

β-紫羅蘭酮、雪松醇：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均為95.9%，批號(hào)分別為280040、240010，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

2-異丁基-3-甲氧基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 mg/L，批號(hào)為CDCT-C14394700，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

茶葉樣品：市售。

1.2 溶液的配制

β-紫羅蘭酮、雪松醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取β-紫羅蘭酮、雪松醇各10.0 mg，分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，質(zhì)量濃度均為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：將質(zhì)量濃度均為100 mg/L芳樟醇、薄荷腦、香葉醇、β-紫羅蘭酮和雪松醇標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度均為10.0 µg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：用甲醇溶液將2-異丁基-3-甲氧基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為50.0 µg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：各移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0、30.0、50.0、70.0、100、200、500 µL，分別置于預(yù)先加有3 g氯化鈉和10.0 mL超純水的頂空樣品瓶中，配制成各組分的質(zhì)量濃度均分別為10.0、30.0、50.0、70.0、100、200、500 ng/L，各加入20 µL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為100 ng/L。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 氣相色譜儀

色譜柱：HP-5 ms石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 µm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；載氣：氦氣，體積分?jǐn)?shù)為99.999%；柱流量：1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣體積：1.0 µL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min速率升溫至110 ℃，保持1 min；然后以10 ℃/min速率升溫至260 ℃，保持5 min。

1.3.2 質(zhì)譜儀

電子轟擊源：EI源；離子化能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：260 ℃；掃描模式：選擇離子檢測(cè)（SIM）方式；溶劑延遲時(shí)間：9.0 min；5種目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)化合物的保留時(shí)間、定量離子、定性離子見表1。

表1   5種目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)化合物的保留時(shí)間、定量離子、定性離子

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法

固相微萃取纖維頭首次使用前，需在老化箱中于 250 ℃條件下老化 60 min；后續(xù)每分析一個(gè)樣品前，需再次在 250 ℃條件下活化 5 min。在18 mm螺紋口頂空樣品瓶中依次加入粉碎后的茶葉樣品0.1 g、氯化鈉3 g，再加入10.0 mL超純水和20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻，密封，將其置于樣品盤上。采用膜厚為65 µm的DVB/PDMS萃取纖維，設(shè)置樣品萃取溫度為60 ℃，振蕩萃取時(shí)間為40 min，振蕩器轉(zhuǎn)速為500 r/min，在250 ℃氣相進(jìn)樣口解析3 min后進(jìn)樣分析。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

為增強(qiáng)方法通用性，色譜柱選擇常用的HP-5 ms 石英毛細(xì)管色譜柱(30 m× 0.25 mm，0.25 µm）對(duì)5種化合物進(jìn)行分離。根據(jù)化合物沸點(diǎn)優(yōu)化進(jìn)樣口溫度、程序升溫條件、接口溫度以及離子源溫度等分析條件。參考NIST數(shù)據(jù)庫(kù)，從標(biāo)準(zhǔn)溶液全掃描的數(shù)據(jù)中確定不同目標(biāo)化合物的定性離子和定量離子。在1.3儀器工作條件下，目標(biāo)化合物總離子流色譜圖如圖1所示。

  1—芳樟醇；2—2-異丁基-3-甲氧基吡嗪； 3—薄荷腦； 4—香葉醇； 5—β-紫羅蘭酮； 6—雪松醇圖1　目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)總離子流色譜圖

t/min

從圖1可以看出，目標(biāo)化合物色譜峰完全分離，峰形尖銳，對(duì)稱性好，響應(yīng)值高。

2.2 頂空固相微萃取條件優(yōu)化

2.2.1 萃取纖維的選擇

萃取纖維直接影響萃取效率和選擇性。常見的萃取纖維主要有非極性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)適合非極性和弱極性化合物；極性的聚丙烯酸酯(PA)適合極性化合物；復(fù)合涂層二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)，以及碳寬范圍(WR/PDMS)適用多種極性化合物。萃取纖維吸附量取決于膜厚，常見膜厚范圍7~100 µm，膜厚大適合揮發(fā)性化合物，增加吸附量；膜厚小適合大分子或半揮發(fā)性化合物，可以減少平衡時(shí)間。按1.3儀器工作條件分別考察了DVB/PDMS膜厚65 µm、WR/PDMS膜厚85 µm、PDMS膜厚100 µm、PA膜厚85 µm 4種常用萃取纖維對(duì)目標(biāo)化合物的富集效果，不同萃取纖維對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積如圖2所示。從圖2可以看出，PDMS和PA，目標(biāo)化合物響應(yīng)比較小，富集效果差。采用復(fù)合涂層的DVB/PDMS和CAR/PDMS富集效果比較好，PDMS/DVB峰面積響應(yīng)最大，萃取效果最佳，因此選擇DVB/PDMS為目標(biāo)化合物萃取纖維，65 µm的膜厚可以更好地平衡吸附量和萃取時(shí)間。

圖2   不同萃取纖維對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積

Fig. 2   Chromatographic peak areas of target substances corresponding to different extracted fibers

2.2.2 萃取溫度的選擇

不同化合物擴(kuò)散速率不同，高溫可以加速擴(kuò)散，但可能降低吸附效率。溫度是影響頂空固相微萃取效率的關(guān)鍵參數(shù)，選擇合適的溫度可以顯著提高萃取效果和分析靈敏度。設(shè)定振蕩萃取時(shí)間為40 min， 轉(zhuǎn)速為500 r/min，于氣相進(jìn)樣口250 ℃解析3 min?？疾炝?0、50、60、80 ℃不同提取溫度條件下5種化合物的提取效率，不同萃取溫度對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積如圖3所示。從圖3可以看出， 當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，能顯著提高氣相濃度，促進(jìn)吸附，同時(shí)避免過(guò)高溫度導(dǎo)致涂層過(guò)熱和目標(biāo)化合物的分解，因此確定萃取溫度為60 ℃。

圖3   不同萃取溫度對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積

Fig. 3   Chromatographic peak areas of target substances corresponding to different extraction temperatures

2.2.3 萃取平衡時(shí)間的選擇

樣品中目標(biāo)化合物在萃取頭涂層與樣品基質(zhì)之間達(dá)到分配平衡需要一定時(shí)間，這就是平衡時(shí)間。不同膜厚的萃取纖維需要的平衡時(shí)間也不相同。分別在30、40、50、60 min 4個(gè)不同萃取時(shí)間下測(cè)定相應(yīng)目標(biāo)化合物的色譜峰面積，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，當(dāng)萃取時(shí)間為40 min時(shí)，5種化合物均有較好的響應(yīng)值，當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)40 min時(shí)，響應(yīng)值增加并不明顯，可能接近或達(dá)到了吸附平衡，萃取量對(duì)萃取時(shí)間變化不敏感，小幅時(shí)間波動(dòng)對(duì)結(jié)果影響小。40 min能在保證一定萃取效率的同時(shí)，縮短整體分析周期，適合批量樣品處理，故選擇萃取平衡時(shí)間為40 min。

圖4   不同萃取時(shí)間對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積

Fig. 4   Chromatographic peak areas of the target substance corresponding to different extraction times

2.2.4 氯化鈉用量的選擇

在頂空固相微萃取中，氯化鈉主要通過(guò)鹽析效應(yīng)影響目標(biāo)物的萃取效率。加入氯化鈉可降低目標(biāo)物在水中的溶解度，促使其向頂空相揮發(fā)，但是過(guò)量地加入氯化鈉會(huì)產(chǎn)生鹽結(jié)晶堵塞頂空瓶和污染萃取纖維。在茶葉樣品中分別加入0、1、2、3、4、5 g氯化鈉，不同氯化鈉加入量下各化合物的色譜峰面積如圖5所示。

圖5   不同氯化鈉用量對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積

Fig. 5   Chromatographic peak areas of target substances corresponding to different sodium chloride dosages

從圖5可以看出，氯化鈉加入質(zhì)量為0~3 g時(shí)，除β-紫羅蘭酮外，其他化合物均隨著氯化鈉加入量的增大，色譜峰面積響應(yīng)值也隨之增大；當(dāng)氯化鈉加入質(zhì)量大于3 g時(shí)，5種目標(biāo)化合物的色譜峰面積響應(yīng)值綜合趨于平穩(wěn)。在10 mL超純水中加入3 g氯化鈉，是常見安全閾值，既能顯著增強(qiáng)鹽析效果，又可避免鹽析沉淀或溶液過(guò)稠影響物質(zhì)傳遞，因此最終確定氯化鈉加入量為3 g。

2.2.5 攪拌速度的優(yōu)化

攪拌可以減少樣品基質(zhì)中分析物向纖維表面的擴(kuò)散阻力，縮短平衡時(shí)間，避免局部濃度耗盡，確保纖維接觸更多目標(biāo)物，能夠顯著提高頂空固相微萃取效率，合適的攪拌速度可減少實(shí)驗(yàn)誤差。高速攪拌可能會(huì)影響萃取纖維對(duì)已揮發(fā)組分的吸附效率，甚至導(dǎo)致纖維涂層磨損，因此需對(duì)攪拌速度加以控制和優(yōu)化。在DVB/PDMS萃取纖維，萃取時(shí)間為40 min，萃取溫度為60 ℃，氯化鈉加入質(zhì)量為3 g，解吸時(shí)間為5 min的固相微萃取條件下，考慮到萃取設(shè)備攪拌速度為250~750 r/min，因此設(shè)定攪拌速度分別為250、500、750 r/min，不同攪拌速度對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積如圖6所示。

圖6   不同攪拌速度對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積

Fig. 6   Chromatographic peak areas of target substances corresponding to different stirring speeds

從圖6可以看出，當(dāng)攪拌速率為500 r/min時(shí)，芳樟醇，薄荷醇和β-紫羅蘭酮色譜峰響應(yīng)值最大。攪拌速率從250 r/min到750 r/min對(duì)香葉醇的色譜峰響應(yīng)值差距不明顯，雪松醇色譜峰響應(yīng)值隨著轉(zhuǎn)速的增大反而有所降低。綜合考慮，最終確定攪拌速率為500 r/min。

2.2.6 解吸時(shí)間的優(yōu)化

頂空固相微萃取的解吸在氣相進(jìn)樣口進(jìn)行。解析時(shí)間優(yōu)化是確保目標(biāo)化合物完全從纖維涂層釋放至氣相色譜進(jìn)樣口的關(guān)鍵步驟。若解吸時(shí)間不足，則富集的樣品解吸不徹底，目標(biāo)組分殘留在萃取纖維上，則導(dǎo)致回收率偏低；如果進(jìn)樣口持續(xù)高溫長(zhǎng)時(shí)間解吸，會(huì)導(dǎo)致萃取纖維表面涂層發(fā)生鈍化，縮短其使用壽命。在使用DVB/PDM萃取纖維、萃取時(shí)間為40 min、萃取溫度為60 ℃、氯化鈉質(zhì)量為3 g、萃取設(shè)備攪拌速度為500 r/min的條件下，設(shè)定解析時(shí)間分別為1、3、5 min，解析效率如圖7所示。從圖7可以看出，芳樟醇、薄荷醇和香葉醇在解析時(shí)間為3 min時(shí)響應(yīng)值最大。β-紫羅蘭酮和雪松醇解析時(shí)間選擇1~5 min時(shí)的響應(yīng)值相差不大，因此最終確定解吸時(shí)間為3 min。

圖7   不同解吸時(shí)間對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰面積

Fig. 7   Chromatographic peak areas of target substances corresponding to different desorption times

2.3 線性范圍及檢出限

在1.3儀器工作條件下測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。當(dāng)置信水平為99%時(shí)，以3倍信噪比（S/N）時(shí)的濃度計(jì)算方法檢出限，5種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度、線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限見表2。由表2可知，5種特征香味物質(zhì)質(zhì)量濃度在10～500 ng/L范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.997，方法檢出限為0.2～0.9 µg/kg。

表2   5種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度、線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

Tab. 2   5 target compound mass concentrations, linear equations, correlation coefficients, linear ranges, and detection limits

2.4 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)

六堡茶樣品中芳樟醇和香葉醇試液質(zhì)量濃度較高，取適量浸出液，用超純水稀釋至100倍體積，在1.3儀器工作條件下進(jìn)行低、高2個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，5種目標(biāo)化合物的加標(biāo)平均回收率為86.0%～103%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～9.9%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度，滿足測(cè)定要求。

表3   樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 3   Results of sample the spiked recovery test

注：“-”表示未檢出。

 

3 結(jié)論

建立了六堡茶中5種特征化合物的頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法。該方法檢出限低，且準(zhǔn)確度、精密度均滿足六堡茶特征化合物的測(cè)定要求，為六堡茶香氣成分分析提供了可靠的技術(shù)支撐。

在實(shí)際樣品測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，芳樟醇與香葉醇在樣品中的含量較高，需對(duì)樣品進(jìn)行稀釋處理以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；其余3種特征成分的樣品溶液質(zhì)量濃度均處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，可直接進(jìn)行定量分析，無(wú)需調(diào)整樣品處理步驟。

從方法特性來(lái)看，頂空固相微萃取技術(shù)具備顯著優(yōu)勢(shì)：萃取效率高，能高效富集目標(biāo)香氣成分；無(wú)需借助有機(jī)溶劑，從根源上避免溶劑污染，契合綠色化學(xué)原則；自動(dòng)化程度高，操作便捷，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用于其他類型及品種的茶葉樣品檢測(cè)。

該方法不僅可作為茶葉香氣成分定性篩查與定量分析的重要手段，助力探尋各類茶葉的特征香氣因子，還能為茶葉品質(zhì)評(píng)價(jià)、風(fēng)味調(diào)控及產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展提供關(guān)鍵技術(shù)支持，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值與推廣前景。

 

 

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