強(qiáng)制降解試驗(yàn)（Forced Degradation Study）是在比加速試驗(yàn)更劇烈的條件下考察藥物穩(wěn)定性，以闡明降解途徑、驗(yàn)證分析方法專屬性并可能成為指導(dǎo)處方工藝優(yōu)化的重要手段。藥品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過(guò)程中可能無(wú)意接觸金屬離子（如不銹鋼管路中的鐵離子、輔料中的銅離子等），這些金屬離子可催化氧化反應(yīng)，產(chǎn)生常規(guī)氧化條件下不出現(xiàn)的降解產(chǎn)物。然而，不加區(qū)分地使用金屬離子催化氧化可能造成過(guò)度降解或誤導(dǎo)性結(jié)果。因此，明確金屬離子催化的必要性判斷標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范實(shí)施方法，對(duì)提高強(qiáng)制降解試驗(yàn)的科學(xué)性具有重要意義。本文通過(guò)對(duì)日常工作中的研究經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行總結(jié)，以期為朋友們提供一些參考。
1、非自由基氧化
氧化降解研究主要方式為樣品溶液暴露于不同濃度、時(shí)間和溫度的過(guò)氧化物條件下，即無(wú)過(guò)渡金屬條件下進(jìn)行的非自由基氧化過(guò)程。通常使用 0.3%~3%（w/w）過(guò)氧化氫作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，這個(gè)濃度為什么這么設(shè)計(jì)倒是沒(méi)有必要去論證，但可以確定的是通過(guò)稀釋標(biāo)準(zhǔn)的30%（w/w）過(guò)氧化氫溶較容易制備0.3%的溶液，也許正是因?yàn)橄♂尫奖恪?/span>
2、自由基氧化
自由基介導(dǎo)的氧化過(guò)程長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為與藥物氧化降解相關(guān)，但是在日常研究中大多數(shù)仍使用過(guò)氧化物進(jìn)行氧化降解，直到在穩(wěn)定性研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一些沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的降解雜質(zhì)，可能才回過(guò)頭來(lái)再進(jìn)行自由基氧化過(guò)程的研究。最常用的自由基引發(fā)劑為偶氮自由基引發(fā)劑，如AIBN（2,2'-偶氮二異丁腈）等。自由基反應(yīng)通常不需要高濃度的氧參與反應(yīng)，對(duì)于一些已經(jīng)添加了脫氧劑但是仍產(chǎn)生氧化降解的制劑來(lái)說(shuō)，建議開(kāi)展自由基氧化過(guò)程研究。需要注意的是，在自由基氧化實(shí)驗(yàn)中可能形成不希望的烷氧自由基（導(dǎo)致形成非藥物相關(guān)的氧化產(chǎn)物），可通過(guò)添加3~10%的甲醇清除這些不希望的烷氧自由基，有報(bào)道顯示在使用偶氮自由基引發(fā)劑與伯胺和仲胺（無(wú)論是否添加甲醇）結(jié)合時(shí)，會(huì)形成 α-氨基腈和尿素，分析時(shí)要注意區(qū)分是否為藥物降解。還需說(shuō)明的是偶氮自由基引發(fā)劑接觸人體會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性，需要做好嚴(yán)格的防護(hù)，這可能也是在當(dāng)前的安環(huán)意識(shí)下大家較少使用的因素之一。
3、過(guò)渡金屬離子氧化
利用金屬離子誘導(dǎo)藥物氧化降解通過(guò)已有文獻(xiàn)可溯源至1970年代，90年代以后使用逐漸廣泛。金屬離子可以通過(guò)與自由基引發(fā)劑不同的機(jī)制引發(fā)自氧化（例如，選擇性絡(luò)合特定部分并引發(fā)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，將痕量過(guò)氧化物還原為自由基，通過(guò)絡(luò)合激活分子氧等）。雖然其他過(guò)渡金屬如 Mn²? 的催化降解作用明確，但仍建議使用 Fe³? 和 Cu²?，一是它們已被大量實(shí)踐證明是可靠的“探針”，能有效地揭示藥物對(duì)金屬催化氧化的內(nèi)在敏感，二是它們所引發(fā)的降解途徑與藥物在真實(shí)世界（生產(chǎn)、儲(chǔ)存）中發(fā)生的氧化降解具有更高的相關(guān)性，這里不作具體原理上的展開(kāi)，感興趣的讀者可以參閱Boccardi G. Oxidative Susceptibility Testing. Pharmaceutical Stress Testing.及Boccardi G etc. Autoxidation of tetra-zepam in tablets: prediction of degradation impurities from the oxidative behavior in solution.等文獻(xiàn)。在一項(xiàng)對(duì)15種藥物的氧化降解研究中，發(fā)現(xiàn)在使用過(guò)氧化物和自由基引發(fā)劑的強(qiáng)制降解研究中形成的 31 種氧化降解產(chǎn)物中，有6種產(chǎn)物也由 Fe³? 和 Cu²? 單獨(dú)降解產(chǎn)生，不止于此的是Fe³? 和 Cu²?還誘導(dǎo)氧化形成了一些額外的在其他條件下未產(chǎn)生的獨(dú)特降解產(chǎn)物，而這些降解產(chǎn)物卻正是實(shí)際在加速和長(zhǎng)期試驗(yàn)中被檢測(cè)到的雜質(zhì)。因?yàn)镕e³? 離子被證明可誘導(dǎo)藥物相關(guān)單電子轉(zhuǎn)移（SET），即通過(guò)形成 π 穩(wěn)定的芳香族自由基陽(yáng)離子，對(duì)某些芳香族藥物分子進(jìn)行苯亞甲基氧化，而過(guò)氧自由基卻不能誘導(dǎo)這種降解途徑。
WHO 指南（TRS 929）討論了使用金屬離子進(jìn)行氧化降解試驗(yàn)的具體條件：Fe³? 或 Cu²?，0.05 M，持續(xù) 1-10 天，作為“可選”測(cè)試項(xiàng)。
該指南推薦的藥物活性成分與上述金屬離子的濃度比為1:1，當(dāng)然根據(jù)實(shí)際氧化降解率可以進(jìn)行濃度的進(jìn)一步調(diào)整，下文將進(jìn)一步論述。
l問(wèn)題：多種氧化條件疊加行不行？
我們也看到有些同事/同行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)采用了多條件疊加，如過(guò)氧化氫疊加過(guò)度金屬離子的方式，筆者查閱了大量技術(shù)指南和頭部跨國(guó)制藥公司公開(kāi)發(fā)表的技術(shù)文章，沒(méi)有見(jiàn)到這種設(shè)計(jì)方案，故強(qiáng)烈不建議疊加。主要是這種方式會(huì)使得降解機(jī)理變的十分復(fù)雜，一是不利于降解產(chǎn)物的分析和后續(xù)穩(wěn)定性期間雜質(zhì)的調(diào)查，二是極易產(chǎn)生過(guò)度降解產(chǎn)物。
三、降解終點(diǎn)的判定
終點(diǎn)1：基于降解百分比的終點(diǎn)
對(duì)某種降解條件比較敏感，容易發(fā)生降解的藥物，當(dāng)總降解量達(dá)到5% - 20%時(shí)，即視為達(dá)到終點(diǎn)。它不看花了多長(zhǎng)時(shí)間或用了多強(qiáng)的條件，只看降解了多少，一旦降解程度落在這個(gè)區(qū)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)就可以停止。目的是確保產(chǎn)生了足夠的降解產(chǎn)物，足以用來(lái)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證穩(wěn)定性指示方法，同時(shí)避免過(guò)度降解產(chǎn)生非相關(guān)雜質(zhì)。
終點(diǎn)2：推薦的藥物相關(guān)應(yīng)變量（RAPRS）
在強(qiáng)制降解研究中，對(duì)于不容易降解的“穩(wěn)定”藥物，可能怎么施加條件都看不到明顯的降解（達(dá)不到 5%-20% 的降解率）。這時(shí)我們會(huì)遇到一個(gè)問(wèn)題：到底要做多久、做到什么程度才能停止實(shí)驗(yàn)，并在結(jié)論中說(shuō)“本品對(duì)該條件穩(wěn)定”？ 如巴西國(guó)家衛(wèi)生監(jiān)督局（ANVISA）法規(guī)及相關(guān)指南（RDC No. 53）中描述了關(guān)于藥物強(qiáng)制降解研究的詳細(xì)信息，表示制劑降解研究應(yīng)實(shí)現(xiàn)大于10%且小于導(dǎo)致樣品完全降解的降解，若降解率低于10%則企業(yè)必須提供技術(shù)說(shuō)明。RAPRS 就是為了解決這個(gè)問(wèn)題而設(shè)定的“終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)”， 簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，RAPRS 是一條 “及格線” 或 “充分暴露線”，即對(duì)于穩(wěn)定藥物，即使沒(méi)有發(fā)生明顯降解，也要施加到推薦的藥物相關(guān)應(yīng)變量 (RAPRS)，此時(shí)視為達(dá)到終點(diǎn)。它不看降解了多少，而看是否施加了足夠強(qiáng)度的條件。只要達(dá)到了RAPRS 標(biāo)準(zhǔn)，即使藥物降解量為0%，實(shí)驗(yàn)也可以停止。目的是為穩(wěn)定藥物提供一個(gè)統(tǒng)一的、科學(xué)的“停手”依據(jù)，防止無(wú)休止地加嚴(yán)條件，同時(shí)也能有信心地得出“本品在此條件下穩(wěn)定”的結(jié)論。
l問(wèn)題：過(guò)度金屬離子氧化的RAPRS是多少？
根據(jù)工業(yè)界的一些文獻(xiàn)，參考條件為：0.1-1mM的Fe³?和/或Cu²?鹽在25-40°C條件下，持續(xù)1天。這里的濃度上限雖然達(dá)到了1mM，但事實(shí)上金屬離子的濃度可以非常低（例如0.1mM），大量的文獻(xiàn)表明低濃度仍然有效?？梢曰谝韵录僭O(shè)進(jìn)行推斷，假設(shè)API濃度為0.4mg/mL，分子量為400，那么0.1mM的Fe³? 或 Cu²?與API發(fā)生非催化SET（即最差的情況）反應(yīng)，理論上足以導(dǎo)致約10%的API降解，這恰好落在終點(diǎn)1的范圍內(nèi)（5-20%）。
簡(jiǎn)言之：“要么降解夠了停（終點(diǎn)1），要么做夠量了停（終點(diǎn)2），先到先停，總降解可控制在不超過(guò)20%。
通過(guò)以上整理與分析，希望對(duì)大家在使用金屬離子進(jìn)行氧化強(qiáng)制降解試驗(yàn)過(guò)程中有所啟發(fā)。
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