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摘 要： 建立超高效液相色譜-三重四級(jí)桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定化妝品中苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚4種組分含量 。水劑、乳液、凝膠、油劑基質(zhì)的化妝品樣品經(jīng)80%甲醇超聲提取，采用C18色譜柱梯度洗脫分離，以5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇作為流動(dòng)相，質(zhì)譜配備電噴霧離子源（ESI），采用正離子和負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行測定。4種組分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均不小于 0.999 1，檢出限為0.08～0.4 mg/kg，定量限為0.2～0.8 mg/kg。低、中、高3個(gè)濃度水平的空白基質(zhì)加標(biāo)回收率為 95.2%～111%，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～8.4%（n=6）。該方法為化妝品中苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚的定性及定量分析提供了一種準(zhǔn)確快捷的檢測手段。

 

關(guān)鍵詞： 苦參堿； 芍藥苷； 黃芩苷； 丹皮酚； 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法； 化妝品

 

隨著消費(fèi)者對(duì)綠色、天然和有機(jī)化妝品需求的增長，傳統(tǒng)中藥提取物因其多功效、低刺激的特點(diǎn)成為化妝品研發(fā)的熱點(diǎn)［1-4］。牡丹、芍藥等植物及其制成的中藥具有抗過敏、抗炎功效，且其主要特征成分（如芍藥苷、丹皮酚）的抗過敏與抗炎作用，已得到大量研究證實(shí)［5-8］。黃芩根提取物是目前化妝品中常用的植物原料，多用于皮膚舒緩類產(chǎn)品，起抗炎、抗過敏作用［9-11］，黃芩苷為黃芩藥材中主要含量測定成分［12］。黃芩苷是一種黃酮類誘導(dǎo)體，其抗炎和免疫調(diào)控作用尤為突出［13］。苦參根提取物在化妝品及護(hù)膚品中常作為柔潤劑、皮膚調(diào)理劑使用，其有效成分為苦參堿，不僅可用于濕疹、皮炎的改善，還具有抗菌消炎功效，能有效調(diào)理肌膚與頭發(fā)，使其保持滋潤且富有光澤［14-16］。

 

目前，關(guān)于化妝品中芍藥苷、黃芩苷、丹皮酚的檢測以高效液相色譜法［17-18］為主，而關(guān)于化妝品中苦參堿的研究相對(duì)匱乏。由于化妝品的種類多樣、基質(zhì)復(fù)雜，并且植物提取物在化妝品中的添加量一般較低，高效液相色譜法的靈敏度難以滿足檢測需求。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其專屬性強(qiáng)、快速靈敏的特點(diǎn)，被廣泛用于中藥等復(fù)雜體系的多成分同時(shí)定性、定量分析，現(xiàn)有檢測方法多聚焦于單一提取物中的目標(biāo)成分，為更全面地監(jiān)管中藥在化妝品中的應(yīng)用，建立可同時(shí)檢測多種特征成分含量的方法尤為必要。筆者建立超高效液相色譜-三重四級(jí)桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜測定化妝品中苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚定性、定量檢測方法，具有快速、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可為化妝品中功效成分的檢測提供技術(shù)支持。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀： QTRAP 6500 型，美國AB SCIEX公司。電子分析天平：（1）CPA225D型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司；（2）XS105DU型，感量分別為 0.01、0.1 mg，瑞士梅特勒托利多科技有限公司。高功率數(shù)控超聲波清洗器：KH-800KDE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。高速冷凍離心機(jī)：MULTIFUGE X1R型，美國賽默飛公司。旋渦混勻器： IKA MS 3 digital 型，德國艾卡公司。甲醇和乙腈：均為色譜純，德國默克公司?？鄥A、芍藥苷、黃芩苷、丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.2%、98.1%、97.2%、99.9%，批號(hào)分別為110805-202411、110736-202447、110715-202223、110708-202309，中國食品藥品檢定研究院?；瘖y品樣品：水劑類、乳液類、凝膠類、油劑類化妝品各1批，市售。實(shí)驗(yàn)用水：蒸餾水，廣州屈臣氏飲料有限公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱[100 mm×2.1 mm，2.7 μm，安捷倫科技（中國）有限公司]；柱溫：30 ℃；樣品控溫：30 ℃；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為5 mmol/L乙酸銨溶液；流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1   流動(dòng)相梯度洗脫程序

Tab.1   Gradient elution procedure of mobile phase

 

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；監(jiān)測模式：正、負(fù)離子多反應(yīng)（MRM）監(jiān)測模式；霧化氣：空氣，壓力為379 kPa；輔助氣：空氣，壓力為379 kPa；氣簾氣：氮?dú)猓瑝毫?41 kPa；離子源溫度：550 ℃；電噴霧電壓：4 000 V。各物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2   各物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 2   Mass spectrometry parameters of each substance

注：1）為定量離子。

 

1.3 樣品處理

稱取樣品0.5 g（精確到0.000 1 g），置于15 mL離心管中，準(zhǔn)確加入80%甲醇溶液約8 mL，渦旋30 s混合均勻，超聲提取20 min，靜置至室溫，用甲醇溶液定容至10 mL，混勻，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液作為樣品溶液。同法制備水劑類、乳液類、凝膠類、油劑類空白基質(zhì)溶液。

1.4 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別精密稱取苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.000 01 g），置于不同10 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液溶解并定容，混勻，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的苦參堿、芍藥苷、黃芩苷、丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別移取苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，置于不同的10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液稀釋，制成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別移取苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量于同一10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液稀釋，制成質(zhì)量濃度均為2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，分別用80%甲醇溶液、空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋成各組分質(zhì)量濃度均分別為0.01、0.04、0.1、0.2、0.3、0.5 μg/mL，分別作為溶劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以及4種基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 測定方法

在1.2儀器工作條件下分別測定溶劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液以及4種基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），對(duì)應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。取樣品溶液測定，將對(duì)應(yīng)的定量離子色譜峰面積代入線性回歸方程，得到待測成分的質(zhì)量濃度，再計(jì)算樣品中各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑

甲醇、乙腈和水是化妝品中常用的提取試劑?？鄥A、芍藥苷和丹皮酚易溶于甲醇；黃芩苷在100%甲醇中溶解性較差，易溶于甲醇-水混合溶劑。在1.2儀器工作條件下，50%甲醇溶液、80%甲醇溶液、100%甲醇溶液中4種待測成分的平均回收率分別為80.9%、98.9%、90.4%。綜合樣品、標(biāo)準(zhǔn)品的特性和平均回收率，最終確定用80%甲醇溶液作為提取溶劑。

2.1.2 超聲提取時(shí)間

以80%甲醇溶液作為提取溶劑，在1.2儀器工作條件下，其他條件不變，利用空白基質(zhì)加標(biāo)樣品考察超聲提取時(shí)間分別為 10、15、20、25、30 min 時(shí)，4 種目標(biāo)組分的平均回收率。結(jié)果顯示，超聲提取 20 min 時(shí)，4 種組分的平均回收率最高；20 min 后，延長超聲時(shí)間并未使平均回收率出現(xiàn)明顯提升，因此確定超聲提取時(shí)間為 20 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化選取

液相色譜常用的甲醇-水與乙腈-水兩種流動(dòng)相體系，比較其對(duì)4種目標(biāo)組分的色譜分離效果。結(jié)果顯示，乙腈洗脫能力更強(qiáng)，在乙腈-水體系下各組分的出峰時(shí)間偏早；而甲醇-水體系出峰時(shí)間更為適宜，且分離效果更優(yōu)。后續(xù)進(jìn)一步考察了2.5 mmol/L乙酸銨溶液、5 mmol/L乙酸銨溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液及0.1%乙酸溶液5種不同水相添加劑的流動(dòng)相性能。采用正離子與負(fù)離子兩種采集模式，發(fā)現(xiàn)水相中添加乙酸銨能改善峰型，還可提高負(fù)離子模式下的檢測響應(yīng)。綜合權(quán)衡各組分分離度與響應(yīng)值，最終確定5 mmol/L 乙酸銨溶液-甲醇作為流動(dòng)相體系。

2.2.2 柱溫的考察

在1.2儀器工作條件下，其他條件保持不變，分別將柱溫設(shè)定為20、25、30、35 ℃進(jìn)行考察。結(jié)果表明，柱溫的變化對(duì)各組分色譜峰形和分離度影響較小，均能滿足方法適應(yīng)性的要求，4種組分平均回收率分別為95.3%、97.8%、100%、99.6%。綜合考慮室內(nèi)溫度和儀器柱溫箱調(diào)節(jié)效率，選擇柱溫為30 ℃。2.2.3 流量的考察分別將流量設(shè)為0.2、0.3、0.4 mL/min進(jìn)行考察，在1.2儀器工作條件下，其他條件不變，結(jié)果表明，3種流量下各組分的平均回收率分別為94.7%、96.9%、95.8%，當(dāng)流動(dòng)相流量為0.3 mL/min時(shí)，色譜峰形拖尾因子較小，因此選擇流量為0.3 mL/min。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

不同物質(zhì)在離子化過程中的帶電能力存在差異。采用針泵進(jìn)樣方式，分別在正離子與負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，并對(duì)母離子、子離子參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，苦參堿在正離子掃描模式下響應(yīng)良好，在負(fù)離子模式下響應(yīng)微弱，故選用正離子（ESI?）掃描模式；丹皮酚、芍藥苷及黃芩苷在負(fù)離子模式下響應(yīng)良好，而在正離子模式下二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子極少，故選用負(fù)離子（ESI?）掃描模式。對(duì)4種目標(biāo)物的母離子分別進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，篩選出2種穩(wěn)定性好、豐度較高的子離子。隨后優(yōu)化各離子對(duì)的去簇電壓（DP）與碰撞能量（CE），以獲得最優(yōu)檢測響應(yīng)。最終選擇響應(yīng)值更高的子離子作為定量離子，另一種子離子則作為定性離子。線性離子阱質(zhì)譜是離子阱質(zhì)譜的一種，其三重四極桿結(jié)構(gòu)中的 Q3 具備捕獲、阱集目標(biāo)離子的功能。在多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式下，通過聯(lián)合增強(qiáng)子離子掃描（EPI）與信息關(guān)聯(lián)采集（IDA）技術(shù)，可獲取目標(biāo)化合物的二級(jí)子離子全掃描信息，為定性分析提供額外輔助判斷依據(jù)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行儀器分析后，采集得到丹皮酚、芍藥苷、苦參堿、黃芩苷EPI質(zhì)譜圖如圖1所示。

圖1   丹皮酚、芍藥苷、苦參堿、黃芩苷EPI質(zhì)譜圖

Fig. 1   EPI mass spectra of paeonol， paeoniflorin， matrine and baicalin

2.4 方法學(xué)試驗(yàn)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

考察基質(zhì)效應(yīng)指樣品中除分析物以外的其他成分對(duì)分析物造成抑制或增強(qiáng)的效應(yīng)，對(duì)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法考察基質(zhì)效應(yīng)（EM），按照1.4配制水劑類、乳液類、凝膠類、油劑類4種基質(zhì)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和溶劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并將基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率進(jìn)行比較，分析不同基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的影響，EM越接近100%，基質(zhì)效應(yīng)越不顯著；當(dāng)EM＞100%時(shí)，說明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)EM＜80%時(shí)，說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)EM＞120%時(shí)，說明基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)較強(qiáng)。4種基質(zhì)類型的基質(zhì)效應(yīng)見表3。

表3   4種基質(zhì)類型的基質(zhì)效應(yīng)

Tab. 3   Matrix effects of four types of matrices

 

根據(jù)表3中EM數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在凝膠、爽膚水和精油中，4種物質(zhì)的EM均在100%～120%之間，潤膚乳中苦參堿的EM接近100%，其他3種物質(zhì)的EM均在100%～120%之間，結(jié)果表明，各基質(zhì)存在一定程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因?yàn)榛瘖y品種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，在實(shí)際樣品檢測過程中難免存在基質(zhì)效應(yīng)，因此選用標(biāo)準(zhǔn)溶液與基質(zhì)匹配校正法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測定。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及方法檢出限

按照1.5方法進(jìn)行線性擬合，計(jì)算線性方程。按照稱樣質(zhì)量0.5 g，定容至10 mL計(jì)算，將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液不斷稀釋，以3、10倍信噪比（S/N）時(shí)的質(zhì)量濃度分別為各組分的檢出限和定量限，根據(jù)取樣質(zhì)量和定容體積換算得到方法檢出限和定量限，不同基質(zhì)類型下4種組分的質(zhì)量濃度、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表4。由表4可知，4種組分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 1，檢出限為0.08～0.4 mg/kg，定量限為0.16～0.8 mg/kg，表明該方法具有較高的靈敏度。

表4   不同基質(zhì)類型下4種組分的質(zhì)量濃度、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Tab. 4   Mass concentration, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantification limit of four components under different matrix types

 

2.4.3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)

稱取水劑類、乳液類、凝膠類、油劑類4種空白基質(zhì)樣品各0.5 g（精確至0.000 1 g），分別置于10 mL離心管中，分別進(jìn)行4種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照1.5方法進(jìn)行6次平行測定，試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，在凝膠中4種組分的平均回收率為98.5%～107%，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%~5.4%；潤膚乳中4種組分的平均回收率為98.9%~111%，RSD為2.2%~6.3%；爽膚水中4種組分的平均回收率為95.2%~108%，RSD為1.5%~8.4%；精油中4種組分的平均回收率為98.3%~106%，RSD為2.5%~7.1%，說明該方法的準(zhǔn)確度較高且精密度良好，滿足方法分析要求。

表5   4種化妝品基質(zhì)中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

Tab. 5   Average recoveries and RSDs （n=6） in four cosmetic matrices

 

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取凝膠、潤膚乳、爽膚水精油4種不同空白基質(zhì)的化妝品各0.5 g，分別加入低、高2種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.5方法進(jìn)行處理，在1.2儀器工作條件下，分別在 0、4、8、12、24 h時(shí)測定，通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得被測物質(zhì)的質(zhì)量濃度，計(jì)算測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，RSD為1.1～6.9%，表明4種組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6   不同基質(zhì)中4種組分的穩(wěn)定性測定結(jié)果

Tab. 6   Stability determination results of four components in different matrices

 

 

3 結(jié)語

采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法，針對(duì)不同基質(zhì)的化妝品，建立了檢測化妝品中苦參堿、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚4種組分的定量檢測方法。各組分的線性范圍、回收率、精密度均滿足檢驗(yàn)檢測技術(shù)要求。該方法靈敏度高，樣品處理簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作高效便捷，為化妝品的安全質(zhì)量和定量篩查提供了技術(shù)支持。

 

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11 陳真，吳姣嬌，潘小紅，等.舒緩類化妝品中功效原料的特征性成分分析［J］.廣東化工，2023，50（16）： 166.
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12 陸林玲，魯輝，閔春艷，等. UHPLC-MS/MS法測定面膜化妝品中甘草、人參和黃芩類功效成分［J］. 日用化學(xué)工業(yè)（中英文），2024，54（1）： 107.
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    LIU Mengxiao，CHEN Linlin，WANG Yan，et al. Research progress on Sophora Flavescens of traditional Chinese medicine［J］. Journal of Pharmaceutical Practice and Service，2025，43（4）： 156.

16 黃煒東. UPLC-MS/MS法測定美白化妝品中10種植物原料指標(biāo)性成分［J］. 日用化學(xué)工業(yè)（中英文），2025，55（04）： 531.
    HUANG Weidong. Determination of 10 indicative components from plant materials inwhitening cosmetics by UPLC-MS/MS［J］.China Surfactant Detergent & Cosmetics，2025，55（4）： 531.

17 程莉，穆曉冬. 高效液相色譜測定除脂生發(fā)片中丹皮酚、黃柏酮、5-O-甲基維斯阿米醇苷和胡薄荷酮［J］. 化學(xué)分析計(jì)量，2024，33 （6）： 94.
    CHENG Li，MU Xiaodong. Determination of paeonol，obacunone，5-O-methylvisamitol side and pulegone in Chuzhi Shengfa Tablets by high performance liquid chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（6）： 94.

18 聶金娥，曲遠(yuǎn)均，錢芳芳，等. 高效液相色譜法測定平喘合劑中芍藥苷和黃芩苷［J］. 化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（10）： 11.
    NIE Jin'e，QU Yuanjun，QIAN Fangfang，et al. Determination of paeoniflorin and baicalin in Pingchuan Heji by high performance liquid chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（10）： 11.