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我們通常講的柱層析一般是指正相柱層析【柱層析技術詳解】，柱子的填料是硅膠。硅膠表面有很多-SiOH基團，因此對于大極性的化合物的吸附能力較強，柱層析洗脫時，硅膠對小極性的化合物吸附能力較弱，所以先被洗脫下來。對于一些極性超大的化合物，硅膠的吸附能力太強以至于用常用的溶劑無法洗脫下來，無法用正相柱層析進行純化。這種情況下就要考慮進行反相柱層析，反相柱層析最常用的填料是C18反相硅膠填料，這類反相硅膠是利用C18烷基硅烷將硅膠的-SiOH基團封住，形成了很多C18鍵合微孔，對于小極性的化合物吸附能強，相反對大極性的化合物的吸附能力弱，因此和正相硅膠的洗脫順序相反，因此稱為反相硅膠。

我們在進行反相柱層析時，梯度洗脫開始以大比例極性水溶液開始，由于C18反相硅膠填料表面疏水性，疏水官能團就會發(fā)生蜷縮，因此使用前需要用極性有機溶劑活化（疏水官能團得以舒展），再過渡到水溶劑（保持其吸附活性）。活化平衡的步驟必不可少，否則會明顯影響分離效率。

實驗室中我們通常使用過柱機進行反相柱層析，但是如果沒有過柱機，可以像正相一樣手動柱層析嗎？當然是可以的。區(qū)別就是C18填料有點貴，需要重復利用，別像普通硅膠一樣過完直接扔掉了。下面小編分享一下加利福尼亞大學圣塔芭芭拉分校的C18反相柱層析標準操作。

這兩個化合物，含有羧基，酚羥基等大極性基團，普通正相柱層析很難分離。反相TLC監(jiān)測發(fā)現(xiàn)分的很開，適合反相柱層析。柱層析操作過程和正相柱層析大同小異。

一、首先在柱子地下鋪一層1cm厚的石英砂。

二、裝入C18反相硅膠，甲醇潤柱，活化硅膠，此步驟必不可少。

三、完全潤濕硅膠后，上層留少量甲醇，輕輕敲擊，使填料上層更加平整。

四、平整后，將甲醇液面壓到硅膠上沿，上層加入2cm厚的沙子。

五、用過柱體系的水相置換柱子里的溶劑，準備上樣。

一般情況下，濕法上樣就可以了，最好用水相體系溶解樣品進行上樣，如果溶解度不好，可以加入少量的有機相促溶。上樣后，加入展開劑梯度洗脫，加入溶劑時不要將上層的沙子沖散。注意事項：由于反相柱的壓力比普通的正相柱大很多，整個操作過程要在通風櫥中進行，并且加壓時將通風櫥拉低，安全第一。梯度洗脫過程中，可以利用正相TLC監(jiān)測反應，如果爬不起來可以嘗試一下EA:AcOH=200:1體系。

六、柱層析結束后，利用甲醇沖洗柱子，下次備用。

常用的水相體系：0.1%TFA水溶液，0.1%碳酸氫銨水溶液。

有機相體系：乙腈，甲醇。