3月18日，F(xiàn)DA發(fā)布了《行業(yè)指南：熱原與內(nèi)毒素檢測(cè)問答（第二版）》，為藥品、生物制品和醫(yī)療器械企業(yè)提供有關(guān)“細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)”和接受標(biāo)準(zhǔn)的建議，如下：
取樣與過程控制
1. 如何制定中控和成品放行的取樣方案？
FDA指出，取樣方案應(yīng)是動(dòng)態(tài)的。企業(yè)應(yīng)從最大覆蓋范圍開始，隨著對(duì)生產(chǎn)工藝?yán)斫獾募由睿磳?duì)防控內(nèi)毒素的信心提升），逐步調(diào)整取樣計(jì)劃。調(diào)整取樣方案時(shí)，必須考慮對(duì)生產(chǎn)工藝一致性、中間產(chǎn)品存放時(shí)間、內(nèi)毒素去除步驟的影響，并及時(shí)更新監(jiān)管申報(bào)文件。對(duì)于藥品和生物制品，此類變更應(yīng)酌情以補(bǔ)充申請(qǐng)或年度報(bào)告的形式提交。對(duì)于器械，提交 30 天通知可能是恰當(dāng)?shù)摹?/span>
2. 何時(shí)可以進(jìn)行復(fù)測(cè)？
當(dāng)試驗(yàn)出現(xiàn)內(nèi)毒素檢測(cè)出現(xiàn)OOS結(jié)果時(shí)，企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格遵循USP <85>的指導(dǎo)。
若失敗發(fā)生在低于最大有效稀釋度（MVD），可采用更高稀釋度（不超過MVD）復(fù)測(cè)。
若失敗恰好在MVD下發(fā)生，且無法歸因于檢測(cè)誤差，該批次應(yīng)直接拒收。
所有復(fù)測(cè)程序必須在事先批準(zhǔn)的SOP中明確規(guī)定。
3. 樣品的儲(chǔ)存和處理是否重要？
非常重要。FDA強(qiáng)調(diào)，儲(chǔ)存和處理方式直接影響內(nèi)毒素的檢出能力。企業(yè)需通過實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)證明在既定儲(chǔ)存和處理?xiàng)l件下，“可檢測(cè)內(nèi)毒素含量”的穩(wěn)定性，并制定細(xì)菌內(nèi)毒素分析用樣品的儲(chǔ)存和處理（包括產(chǎn)品混合）的SOP。試驗(yàn)方案應(yīng)考量研究中所用內(nèi)毒素的來源，純化的內(nèi)毒素與天然來源的內(nèi)毒素在試驗(yàn)中可能表現(xiàn)不同。
合并樣品
4. 成品樣品能否合并檢測(cè)？
可以，但有嚴(yán)格限制。對(duì)于水性藥物，混合樣品可由成品容器的整單位或部分等分試樣（等體積）構(gòu)成。
小容量注射劑（≤100mL）：允許合并，但因存在將含有害水平內(nèi)毒素的單位與含較低、低害水平內(nèi)毒素的單位稀釋的可能性，必須調(diào)整MVD（調(diào)整后MVD = 單個(gè)樣品MVD / 擬合并樣品數(shù)）。FDA建議最多合并3個(gè)單位。若 MVD 的降低因稀釋度不足而導(dǎo)致無法克服與產(chǎn)品相關(guān)的檢測(cè)干擾，則應(yīng)單獨(dú)檢測(cè)各樣品。
醫(yī)療器械：也可采用提取液合并的方式進(jìn)行檢測(cè)。
FDA 建議，混合樣品應(yīng)是從各產(chǎn)品容器中無菌取出的等分試樣（經(jīng)至少 30 秒劇烈混合后）的組合。如此，若混合樣品出現(xiàn)超標(biāo)結(jié)果，原始的單個(gè)容器樣品可用于可能的復(fù)測(cè)。
禁止合并的情況：
初始MVD較低的藥品。
混懸液（因均一性問題）。
不同工序階段的中控樣品。
檢測(cè)方法與替代技術(shù)
5. 能否使用USP之外的替代檢測(cè)方法？
可以，但前提是必須經(jīng)過驗(yàn)證。
替代方法（如動(dòng)力學(xué)法）必須在準(zhǔn)確性、靈敏度、選擇性等方面等同或優(yōu)于藥典方法。一旦出現(xiàn)爭(zhēng)議，最終裁決仍需以USP凝膠法為準(zhǔn)。
指南特別舉例提到了單核細(xì)胞激活法（Monocyte Activation Test） 作為替代熱原試驗(yàn)的示例，但強(qiáng)調(diào)必須進(jìn)行產(chǎn)品特異性驗(yàn)證，包括干擾試驗(yàn)和直接接觸能力驗(yàn)證。
6. 如何從一種BET方法切換到另一種？
驗(yàn)證等效性：對(duì)比新舊方法的檢測(cè)限和抑制/增強(qiáng)作用。
申報(bào)要求：
藥品/生物制品：需提交預(yù)先批準(zhǔn)補(bǔ)充申請(qǐng)（PAS）。若采用通用切換方案，可提交“可比性方案（CP）”審核。
III類器械：可提交“30天通知”。
II類器械：需符合質(zhì)量管理體系法規(guī)。
7. 家兔熱原試驗(yàn)（USP <151>）何時(shí)適用？
雖然細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（BET）廣泛應(yīng)用，但以下情況仍需使用兔法：
法規(guī)強(qiáng)制要求：特定生物制品（21 CFR 610.13 (b)）明確要求。
非內(nèi)毒素?zé)嵩L(fēng)險(xiǎn)：若評(píng)估顯示物料可能存在非內(nèi)毒素?zé)嵩梅ǜ线m。
無法消除干擾：當(dāng)樣品干擾無法通過稀釋（至MVD）或其他驗(yàn)證方法消除時(shí)。
限度與風(fēng)險(xiǎn)管理
8. 1987版指南附錄E的限度表為何取消？
因?yàn)榕f版表格中的劑量和藥物規(guī)格已嚴(yán)重過時(shí)。FDA明確，確立內(nèi)毒素限度的正確方法是使用USP或AAMI標(biāo)準(zhǔn)中的計(jì)算公式。對(duì)于含有多種組分的注射產(chǎn)品，總內(nèi)毒素限度不應(yīng)超過USP <85>規(guī)定的總閾值。
9. QbD理念如何支持內(nèi)毒素檢測(cè)？
FDA鼓勵(lì)將質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD） 理念融入內(nèi)毒素控制。
風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：識(shí)別生產(chǎn)過程中高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)。
定量檢測(cè)優(yōu)于限度檢測(cè)：定量檢測(cè)有助于進(jìn)行趨勢(shì)分析，在超標(biāo)前發(fā)現(xiàn)偏差。
過程限度：過程限度應(yīng)與成品放行標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)。
10. 多物種獸藥的限度如何確定？
對(duì)于獸藥，應(yīng)以最小物種的最大給藥劑量為基準(zhǔn)。若用于幼年和成年動(dòng)物，應(yīng)以幼年動(dòng)物作為最差情況考量。
11. 醫(yī)療器械的內(nèi)毒素限度是多少？
FDA采納了USP <161>的標(biāo)準(zhǔn)：
心血管/淋巴系統(tǒng)接觸：0.5 EU/mL 或 20 EU/器械。
腦脊液接觸：0.06 EU/mL 或 2.15 EU/器械。
眼內(nèi)環(huán)境接觸：通常適用更低限度，需咨詢審評(píng)部門。
提取方法：通常建議用40mL無熱原水沖洗。若采用顯著偏離指南的方法（如更高的放行標(biāo)準(zhǔn)、少于3批的干擾試驗(yàn)取樣），可能需要提交新的510(k)或PMA補(bǔ)充申請(qǐng)。
12. 治療性藥品的常規(guī)篩查稀釋度如何確定？
FDA建議，理想的篩查應(yīng)在未稀釋產(chǎn)品中進(jìn)行。若存在干擾，不應(yīng)直接使用MVD作為常規(guī)篩查稀釋度，而應(yīng)尋找恰好能消除干擾的最低稀釋度。
例如：某產(chǎn)品MVD為1:100，在1:10有抑制，1:20無抑制，則建議在1:30進(jìn)行常規(guī)篩查。若在此水平檢出內(nèi)毒素，再進(jìn)行全面定量。
13. 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSEs）還能用嗎？
可以。 FDA鼓勵(lì)繼續(xù)使用經(jīng)適當(dāng)校準(zhǔn)、可溯源至國(guó)際內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)的CSEs。CSEs作為二級(jí)或三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，因其成本優(yōu)勢(shì)和保護(hù)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)存的作用，已成為行業(yè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和試驗(yàn)對(duì)照來源。
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