寡核苷酸治療藥物（Oligonucleotide therapeutics, ONTs）已成為一類具有變革意義的新型藥物，主要包括siRNA、ASO、mRNA、適配體以及單鏈和雙鏈DNA寡核苷酸等。過去十年中，得益于其良好的安全性以及能夠靶向以往“不可成藥”的通路，這類藥物在制藥研發(fā)管線中的地位日益突出。
寡核苷酸具有模塊化設計特點，使其在早期研發(fā)階段能夠快速迭代優(yōu)化，尤其適用于探索全新作用機制的項目。同時，化學修飾技術與靶向遞送系統(tǒng)的顯著進步——如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶聯(lián)物和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等——大幅提升了組織特異性和治療指數(shù)，從而提高了臨床成功率。
與傳統(tǒng)小分子藥物不同，ONTs展現(xiàn)出獨特的藥代動力學特征：系統(tǒng)清除迅速，但在靶組織中滯留時間較長，導致其PK-PD關系更為復雜。這種特性使得暴露-效應評估變得困難，因為血漿中的系統(tǒng)濃度往往無法準確反映靶組織的實際藥物暴露水平。因此，對治療活性和安全性的評估越來越依賴于組織特異性藥物濃度，凸顯了建立可靠生物分析策略以表征藥物體內(nèi)分布的重要性。
盡管業(yè)界已普遍認識到組織藥物濃度測定的重要性，但各公司在具體實施方法上仍存在較大差異。美國FDA近期發(fā)布的《寡核苷酸治療藥物臨床藥理學考量》草案指南明確強調(diào)，需開展全面的體內(nèi)分布研究，并采用穩(wěn)健的生物分析方法來定量寡核苷酸母藥及其相關代謝物。這一監(jiān)管導向進一步凸顯了行業(yè)亟需就組織水平評估的最佳實踐達成共識。
本文分享下IQ Consortium調(diào)研的11家制藥企業(yè)在ONT體內(nèi)分布評估方面的實際操作情況。
體內(nèi)分布評估的頻率
在10家明確開展ONT研發(fā)的公司中：50%始終在發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段評估體內(nèi)分布；40%根據(jù)具體項目需求或以探索性方式開展；10%則根據(jù)化合物特性靈活決定，而非例行進行。
此外，70%的公司在候選藥物確認過程中常規(guī)測定組織藥物濃度，30%則間歇性開展。
企業(yè)開展常規(guī)體內(nèi)分布評估的主要動因
確認藥物在作用部位的暴露；支持PK/PD建模；評估藥物在靶器官和清除器官中的分布；為基于PBPK和TK模型提供數(shù)據(jù)支持。
組織藥物濃度測定策略與時間節(jié)點
30%的公司將組織濃度分析視為選擇性手段，而非常規(guī)操作。這類評估通常依據(jù)以下關鍵因素觸發(fā)：需確認藥物在藥理相關組織中的分布；監(jiān)測已知或潛在毒性部位的暴露；應對體內(nèi)研究中出現(xiàn)的意外結(jié)果。
在這些情況下，組織水平的PK數(shù)據(jù)成為連接給藥劑量、分布特征與藥效/安全性結(jié)果的關鍵機制橋梁。
評估時間點分布如下：1）先導化合物（lead compoud）優(yōu)化前：50%的公司進行組織濃度測定，主要用于早期藥理篩選；2）先導優(yōu)化至候選藥物(PCC)選定階段：比例升至90%，反映此階段對理想組織分布特性的高度依賴；3）候選藥物確定至首次人體試驗（FIH）前：80%的公司持續(xù)開展組織測定；4）FIH之后：比例回落至50%，表明此時更多依賴前期建立的PK模型和安全性數(shù)據(jù)。
臨床前動物種屬與組織采樣情況
在臨床前研究中，小鼠（包括C57BL/6、CD-1和BALB/c品系）是最常用的動物模型，主要因其疾病模型豐富且所需化合物量少（通常僅需1-3mg）。
大鼠（如Sprague–Dawley和Wistar）則常用于劑量探索研究，作為中間模型。
食蟹猴是主要的非嚙齒類動物模型，被70%的公司采用，原因在于其與人類具有超過85%的靶序列同源性，且核酸酶表達模式相似。
在組織采樣方面：血清或全血是最常采集的基質(zhì)（90%的公司）；肝臟次之（80%），因其是寡核苷酸藥物的主要蓄積和代謝器官；腎臟也被廣泛采樣（60%），作為關鍵清除途徑之一；肌肉和脾臟則僅在特定靶點相關項目中被部分公司采集。
生物分析中的歸一化、一致性與檢測技術
為減少實驗變異并確?？缪芯繑?shù)據(jù)的一致性，各公司采用多種歸一化策略：50%的公司使用獨立生物標志物或其他內(nèi)源性分析物進行歸一化；30%采用總蛋白定量；60%使用其他方法，如加入內(nèi)標或按組織重量歸一化。
這些策略對寡核苷酸項目尤為重要，因為其絕對定量易受基質(zhì)效應、穩(wěn)定性差異及細胞攝取不均等因素干擾。
常用組織濃度檢測技術包括：1）qPCR/RT-qPCR/ddPCR（80%）；2）雜交法（hybridization assays，70%）；3）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS，100%）——因其能特異性識別母體藥物并表征代謝物，已成為行業(yè)標配；4）配體結(jié)合分析（LBA，50%）；5）免疫熒光成像（20%）；6）放射性標記計數(shù)（10%）。
在組織與血漿基質(zhì)間的方法一致性方面：僅有20%的公司始終使用相同分析方法；其余80%根據(jù)基質(zhì)特性或具體分析需求，采用基質(zhì)適配（matrix-dependent）或“適用即用”（fit-for-purpose）策略。
盡管方法各異，所有公司均以組織重量對濃度數(shù)據(jù)進行歸一化。此外，30%的公司還輔以總RNA/DNA含量、看家基因表達水平或外源內(nèi)標進一步校正。
組織樣本中殘留血液污染的處理
血液殘留可能干擾組織藥物濃度的真實評估，但各公司對此處理方式不一：僅20%的公司始終考慮血液污染問題；40%偶爾考慮；40%完全未處理。
為減少血液干擾，部分公司采用器官灌注：10%常規(guī)進行；70%偶爾進行；20%從不進行。
對于不進行灌注的公司，其主要理由是：在組織采集時，系統(tǒng)循環(huán)中的藥物濃度已極低，不太可能顯著影響組織水平的解釋。
提取方法驗證與多方法聯(lián)用策略
在組織樣本的提取效率與回收率驗證方面，各公司做法差異顯著：77.8%的公司偶爾進行驗證；僅11.1%將其作為標準流程；另有11.1%完全不進行此類驗證。
在開展驗證的公司中，通常遵循標準的生物分析開發(fā)流程，包括：方法優(yōu)化、回收率測試以及跨基質(zhì)的重現(xiàn)性研究。
關于是否采用多種檢測方法：80%的公司表示有時會結(jié)合多種分析技術；20%則僅依賴單一平臺。
在生物分析方法的資格認證（qualification）方面：90%的公司采用“適用即用”（fit-for-purpose）策略，根據(jù)具體應用場景定制方法；其中，50%遵循ICH M10指導原則或其他相關監(jiān)管標準；40%使用未經(jīng)正式認證的探索性方法；10%將組織勻漿和提取步驟的驗證納入整體方法資格認證體系。
PK/PD建模應用及其對臨床轉(zhuǎn)化的影響
所有受訪公司均表示，寡核苷酸組織濃度數(shù)據(jù)在一定程度上用于支持人體劑量預測：100%用于指導轉(zhuǎn)化PK建模；80%用于構建臨床前PK/PD模型；40%用于輔助解釋毒理或安全性發(fā)現(xiàn)。
在建模輸入?yún)?shù)選擇上：80%傾向使用總組織濃度；20%更偏好細胞內(nèi)結(jié)合態(tài)濃度（cell-associated concentrations）；此外，30%還采用其他替代指標，如RISC復合物加載量或細胞內(nèi)蛋白復合物定量。
關于組織濃度數(shù)據(jù)對預測模型的價值：90%認為其顯著提升了PK/PD模型在臨床轉(zhuǎn)化中的準確性與相關性；僅10%認為獲益有限，主要受限于數(shù)據(jù)質(zhì)量、生物學變異性或模型擬合困難。
在基于PBPK或mPBPK模型開發(fā)中：80%的公司偶爾使用組織濃度數(shù)據(jù)；10%常規(guī)使用；10%完全不用。
在模型的實際應用方面：40%間歇性使用PBPK/mPBPK框架；20%常規(guī)應用；40%在其ONT項目中未采用PBPK建模。
在安全性評估與關鍵決策中的應用
在將組織濃度數(shù)據(jù)用于安全性評估方面，業(yè)界意見基本持平：50%的公司將這些數(shù)據(jù)納入安全評價；另外50%則未使用。
在使用該數(shù)據(jù)的公司中：40%表示組織濃度有助于解釋毒性機制，并指導后續(xù)開發(fā)決策。
而在未用于安全性評估的公司中：40%認為這些數(shù)據(jù)非必需或不可獲得；20%對其潛在價值持不確定態(tài)度。
綜上，盡管組織濃度數(shù)據(jù)在PK/PD建模和臨床轉(zhuǎn)化中已獲廣泛認可，但在安全性評估中的整合仍存在較大分歧，反映出當前行業(yè)在數(shù)據(jù)應用深度和標準化方面的挑戰(zhàn)。
討論
本次調(diào)研結(jié)果表明，行業(yè)在ONTs組織分布評估方面的差異并非源于分析平臺本身——所有受訪公司（100%）均使用LC–MS，而主要體現(xiàn)在實施策略的不一致上。例如：僅50%的公司始終評估體內(nèi)分布，40%則根據(jù)項目需求靈活決定；提取方法驗證方面，78%僅偶爾開展，僅11%將其作為常規(guī)流程；高達40%的公司完全未處理組織樣本中的血液殘留污染問題。
這些差異反映出當前ONT研發(fā)仍以早期階段項目為主，盡管業(yè)界興趣濃厚，但技術挑戰(zhàn)仍在制約臨床推進。因此，亟需在組織采集與處理流程上建立統(tǒng)一標準，以實現(xiàn)更高效的管線整合。
體內(nèi)分布評估頻率存在差異。評估頻率的不一致，既反映了各公司在資源投入上的權衡，也凸顯了缺乏行業(yè)統(tǒng)一實踐標準的問題。那些堅持系統(tǒng)性評估的公司，通常更清楚寡核苷酸藥物血漿PK與組織PK嚴重脫節(jié)這一核心特征。
評估頻率隨研發(fā)階段動態(tài)變化：在先導化合物優(yōu)化階段達90%（用于篩選理想分布特性）；FIH后降至50%，轉(zhuǎn)而依賴已建立的PK模型。這體現(xiàn)了從“探索性表征”向“模型驅(qū)動決策”的自然演進。
生物分析方法選擇與驗證方面，標準化空間巨大。LC–MS被全行業(yè)采用，因其能特異性識別母藥并解析復雜的體內(nèi)代謝產(chǎn)物。qPCR/RT-qPCR和雜交法作為補充，提供對痕量寡核苷酸的高靈敏度檢測。
驗證實踐差異顯著，“適用即用”策略雖具靈活性，但可能損害跨研究數(shù)據(jù)的可比性。同時，對血液污染處理不一致（僅10%常規(guī)灌注器官）以及驗證流程缺失，均表明亟需建立標準化的生物分析工作流。
PK建模與臨床轉(zhuǎn)化方面，潛力未充分釋放。所有公司均利用組織濃度數(shù)據(jù)支持人體劑量預測，承認僅依賴血漿數(shù)據(jù)外推存在局限。然而，PBPK/mPBPK建模應用率偏低，僅20%常規(guī)使用，40%完全未采用。這是一種未被充分利用的機制性工具，尤其適用于非肝靶向或新型遞送系統(tǒng)的ONT。
多數(shù)公司偏好使用總組織濃度而非細胞內(nèi)結(jié)合態(tài)濃度，雖出于操作便利，但可能無法反映藥理活性部分。RISC加載量等機制性指標使用有限（僅30%），限制了對藥效機制的深入理解。
建議，即使資源有限，也可采用簡化PBPK（mPBPK），聚焦靶器官與清除器官，利用已發(fā)表的內(nèi)吞/溶酶體轉(zhuǎn)運參數(shù)，無需依賴組織活檢，可借助藥效學生物標志物或循環(huán)細胞外囊泡作為組織暴露的替代指標。對監(jiān)管申報而言，PBPK模型能強化藥理學依據(jù)，尤其當敏感性分析揭示種屬間受體表達或核酸酶活性差異時，可有力支持劑量選擇。
需要特別提示的是，siRNA在血漿中半衰期極短（<1小時），但組織濃度可持續(xù)數(shù)周，因此在多數(shù)情況下，血液殘留對組織濃度測定影響可忽略，相關污染評估應依化合物特性而定。
另外，在是否將組織濃度數(shù)據(jù)用于安全性評價上，行業(yè)呈現(xiàn)五五開。使用方（50%）認為其有助于解釋毒性機制、計算安全窗。未使用者中，40%稱“不需要或不可得”，20%則“不確定價值”。鑒于寡核苷酸的毒性常出現(xiàn)在高蓄積組織（如肝、腎），組織數(shù)據(jù)對機制性安全評估至關重要。
值得注意的是，F(xiàn)DA于2024年6月發(fā)布的指南（Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry）明確強調(diào)需開展全面的體內(nèi)分布研究，表明監(jiān)管機構已將基于組織的評估視為必要要求。
引自：Industry Practices in Oligonucleotide Tissue Biodistribution Assessment: An IQ consortium Cross Industry Survey of Current Approaches and Emerging Trends
京公網(wǎng)安備11010802046783號
