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摘 要： 建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉及茶葉制品中丙烯酰胺。樣品經(jīng)乙腈超聲提取，采用XB-C18 100 A型色譜柱分離，以0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL。采用電噴霧離子源、正負(fù)離子同時監(jiān)測、多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描。丙烯酰胺的質(zhì)量濃度在5～1 000 μg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.990，方法檢出限為1 μg/kg，定量限為3 μg/kg。精密度試驗(yàn)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%（n=6），樣品平均回收率為76.8%～91.6%。采用所建方法對實(shí)際樣品進(jìn)行了測定，具有較強(qiáng)的可行性和實(shí)用性。該方法快速簡便、方法靈敏度高、重復(fù)性、準(zhǔn)確性好，可為茶葉和茶葉制品中丙烯酰胺含量的快速檢測提供了一些技術(shù)參考。

 

關(guān)鍵詞： 茶葉； 茶葉制品； 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 丙烯酰胺

 

茶葉在我國有悠久的歷史和傳承。茶葉和茶葉制品（包含含茶制品、代用茶）作為深受消費(fèi)者的喜愛的消費(fèi)品，其安全問題受到越來越多的關(guān)注［1-2］。丙烯酰胺，分子式為C3H5NO，2002年4月由瑞典科學(xué)家首次在油炸馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)［3］。丙烯酰胺極易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮，可以通過皮膚、黏膜、呼吸道和胃腸道等多種途徑方式進(jìn)入體內(nèi)［4］，對遺傳、免疫、神經(jīng)、生殖等多系統(tǒng)帶來不可逆轉(zhuǎn)的破壞［5-7］。丙烯酰胺在世衛(wèi)組織（WHO）下屬的IARC歸類為2 A類致癌物［8］，在熱處理食品如油炸土豆片、烘焙咖啡、焙烤面包和茶葉都有發(fā)現(xiàn) ［9-10］。目前GB 5009.204—2014《食品中丙烯酰胺的測定》及茶葉相關(guān)產(chǎn)品國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對于茶葉及茶葉制品中丙烯酰胺的限量及技術(shù)要求尚未有明確規(guī)定。食品、紡織品和化妝品等產(chǎn)品中丙烯酰胺測定方法主要包括高效液相色譜法［11-12］、氣相色譜法［13-14］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［15］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法［16-20］。氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，樣品需進(jìn)行衍生化或固相萃取等處理，處理過程繁雜且成本高。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法操作簡便、選擇性好、靈敏度高，在諸多領(lǐng)域具有更加廣泛的運(yùn)用。目前對于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法茶葉中的丙烯酰胺的檢測報道較少，尤其是茶葉制品中丙烯酰胺檢測未見報道。筆者建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測定茶葉及茶葉制品中丙烯酰胺，利用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，多反應(yīng)檢測模式下對儀器工作參數(shù)、提取溶液、流動相等條件進(jìn)行了優(yōu)化，該方法快速簡便，可實(shí)現(xiàn)對茶葉及茶葉制品中丙烯酰胺含量的快速準(zhǔn)確測定。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀：（1）SCIEX 4500型，配有ESI源，上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；（2）1290型超高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。離心機(jī)：H1850型，湘潭儀器儀表有限公司；分析天平：TLE204/02型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多國家貿(mào)易（上海）有限公司。超聲波清洗器：KQ-250E型，昆山超聲儀器有限公司。丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) 085334，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。丙烯酰胺-13C3同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為91348JA，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。乙腈、甲酸：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。N-丙基乙二胺吸附劑、十八烷基鍵合硅膠吸附劑：天津博納艾杰爾科技有限公司石墨化炭黑：德國達(dá)姆施塔特默克集團(tuán)。無水硫酸鎂：分析純，成都隆化學(xué)品有限公司。茶葉及茶葉加工制品樣品：市售。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：飛諾美XB-C18 100A型柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；流動相：A相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸溶液，B相為乙腈；流量：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源；電離模式：正離子模式；噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：氮?dú)?，壓力?07 kPa；噴霧氣：空氣，壓力為345 kPa；輔助氣：空氣，壓力為345 kPa；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子對的駐留時間：0.100 s。丙烯酰胺及丙烯酰胺-13C3的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2   丙烯酰胺及丙烯酰胺-13C3的質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 2   Mass spectral parameters of acrylamide and acrylamide-13C3

注：*為定量離子。

 

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 溶液配制

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：10 μg/mL。移取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線并搖勻。丙烯酰胺-13C3同位素內(nèi)標(biāo)溶液：10 μg/mL。移取丙烯酰胺-13C3同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線并搖勻。丙烯酰胺系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取適量體積丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，并移取0.1 mL丙烯酰胺-13C3同位素內(nèi)標(biāo)中間溶液，用甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，配制成丙烯酰胺質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200、500、1 000 μg/L的丙烯酰胺系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理

將茶葉和固體茶葉制品樣品粉碎，稱取粉碎后的樣品2.0 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL離心管中，加入0.15 mL內(nèi)標(biāo)溶液和5 mL水，浸泡30 min，后加入15 mL乙腈，超聲均勻分散處理30 min，加入1.5 g無水乙酸鈉和6 g無水硫酸鎂，超聲振蕩1 min，后以4 200 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取上清液至內(nèi)含除水劑和凈化材料（每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、50 mg C18、50 mg PSA和25 mg GCB）的離心管中，渦旋混勻1 min，，以4 200 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

1.3.3 測定方法

將丙烯酰胺系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣測定，以丙烯酰胺與丙烯酰胺-13C3內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時測定樣品溶液中丙烯酰胺色譜峰面積，計算丙烯酰胺含量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取溶液的選擇

茶葉及茶葉制品樣品基質(zhì)復(fù)雜，其中含有的茶多酚、咖啡因、色素、有機(jī)酸等易與丙烯酰胺同時被提取劑提取，干擾測定，因此需對提取溶液進(jìn)行凈化處理，降低雜質(zhì)成分的干擾。分別考察了水、水-乙腈、甲醇、乙腈4種不同溶劑作為提取溶液，考察茶葉中丙烯酰胺提取回收率，如圖1所示。從圖1中可以看出，以純水作為提取溶劑時，回收率較低，而采用水-乙腈提取的方式對茶葉及茶葉制品中的丙烯酰胺進(jìn)行提取，丙烯酰胺提取效果好，回收率最高，且色譜峰形較好，因此選擇水-乙腈作為提取溶液。

圖1   不同提取溶液的丙烯酰胺平均回收率

Fig. 1   Average recovery of acrylamide in different extraction solutions

2.3 流動相的選擇

分別考察了以乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相對丙烯酰胺檢測結(jié)果的影響，丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)離子流圖如圖2所示。從圖2中可以看出，選用0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相時，丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值和峰形最好，因此選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相。

圖2   丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)總離子流色譜圖

Fig. 2   Total ion chromatograms of acrylamide and its internal standard

2.3 線性范圍、檢出限及定量限

用空白綠茶基質(zhì)提取液配制丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以丙烯酰胺質(zhì)量濃度與丙烯酰胺-13C3內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)，丙烯酰胺峰面積與丙烯酰胺-13C3內(nèi)標(biāo)溶液峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定量的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度為100 μg/L），用甲醇稀釋，在1.2儀器工作條件下測定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算方法檢出限和定量限。根據(jù)取樣質(zhì)量、定容體積以及樣品溶液稀釋倍數(shù)換算成樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/kg)表示。結(jié)果表明，丙烯酰胺的質(zhì)量濃度在5～1 000 μg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.990，方法檢出限為1 μg/kg，定量限為3 μg/kg。

2.4 精密度試驗(yàn)

取已知的空白綠茶樣品6份，加入20 μg/kg濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2處理后，在1.2儀器條件下測定，計算茶葉樣品中丙烯酰胺含量，精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，丙烯酰胺測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.6%，方法精密度滿足測試要求。

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

以不含丙烯酰胺的不同種類的茶葉及茶葉制品作為空白基質(zhì)，分別按5、25、100 μg/kg加入3個質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平取3份平行樣，在1.2儀器工作條件下測定，計算其加標(biāo)回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，不同種類茶葉中丙烯酰胺加標(biāo)回收率為78.1%～91.2%，茶葉制品中丙烯酰胺加標(biāo)回收率為76.8%～91.6%，回收率滿足測試要求。

表4   精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 4   Results of precision test

 

表4   樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 4   Results of sample spiked recovery

 

2.6 實(shí)際樣品測試

采用新建立的UPLC-MS/MS法對30個茶葉及茶葉制品樣品中的丙烯酰胺檢測，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，有超過95%的樣品中丙烯酰胺含量低于100 μg/kg。茶葉高溫處理階段溫度及時間控制的不同，所發(fā)生“美拉德反應(yīng)”的程度不盡相同，這種加工工藝的差異可能是致使不同種類茶葉中丙烯酰胺含量差異的主要原因。溫度的提升使丙烯酰胺的生成量增加，而揉捻時間延長和熱風(fēng)干燥溫度升高則會使得丙烯酰胺的生成量降低［21-22］。而在茶葉制品的樣品中都未檢出丙烯酰胺，這可能與該類制品的加工生產(chǎn)中添加茶葉比例較少有關(guān)。參照歐盟委員會法規(guī)（EU）2017/215對同類產(chǎn)品中丙烯酰胺的限量要求，速溶咖啡的限值為不大于850 μg/kg，烘焙咖啡為不大于400 μg/kg。30個批次的茶葉及其加工制品中所有樣品的丙烯酰胺含量都在參考的限量標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)。

圖3   茶葉及茶葉制品丙烯酰胺監(jiān)測結(jié)果

Fig. 3   Results of acrylamide monitoring in tea and tea products

 

3 結(jié)論

（1）建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉及茶葉制品中丙烯酰胺含量的方法。該方法樣品處理簡單，基質(zhì)干擾小，靈敏度高，適用于茶葉和茶葉制品中的丙烯酰胺含量測定。（2）采用建立的方法對30個茶葉及茶葉制品樣品進(jìn)行了測定，適用于茶葉及茶葉制品中丙烯酰胺的實(shí)際檢測，具有較強(qiáng)的可行性和實(shí)用性，為茶葉及茶葉制品中丙烯酰胺安全風(fēng)險監(jiān)測提供了一定的技術(shù)參考。我國茶葉及制品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)均未規(guī)定丙烯酰胺限量。該物質(zhì)可能在其加工中產(chǎn)生，存在安全風(fēng)險，建議制修訂標(biāo)準(zhǔn)時納入其限量要求，以規(guī)范生產(chǎn)銷售，提升行業(yè)質(zhì)量安全水平，進(jìn)一步保障消費(fèi)者安全。（3）目前該方法所測試茶葉及茶葉制品的種類比較有限，需進(jìn)一步驗(yàn)證方法的適用性。儀器優(yōu)化條件及基體效應(yīng)的抑制還需更加完善進(jìn)一步提升方法的準(zhǔn)確性。

 

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