苯甲酸（BA）、山梨酸（SA）是傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑，因價(jià)格低廉，抑菌效果好，而被廣泛地用于食品中。然而過多地?cái)z入這類防腐劑可能導(dǎo)致人體酸中毒和驚厥，或引發(fā)哮喘、蕁麻疹等疾病，對人體健康產(chǎn)生潛在的危害。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，醬油和食醋中苯甲酸、山梨酸的限量均為1.0g·kg−1。因此，建立準(zhǔn)確、簡便、低成本測定食品中苯甲酸和山梨酸含量的方法尤為重要。
測定食品中苯甲酸和山梨酸含量的分析方法包括食品基質(zhì)的前處理方法和儀器測定方法。食品中苯甲酸和山梨酸的前處理方法有直接稀釋法、純水提取法、有機(jī)溶劑提取法、蒸餾法、固相萃取法、中空纖維膜液相微萃取法等，然而這些方法存在凈化效果差、有毒試劑消耗量大、處理時(shí)間長、成本高等缺點(diǎn)。分散液液微萃?。―LLME）技術(shù)是一種新的集萃取、濃縮于一體的前處理手段，因其消耗溶劑少、萃取快速，近年來被廣泛應(yīng)用。但是該方法常用的萃取劑（如三氯化碳、四氯化碳、1,2-二氯乙烷等）密度均大于水，離心后落于試管底部，移取困難，且這些試劑毒性較大。文獻(xiàn)在DLLME的基礎(chǔ)上提出一種新型萃取技術(shù)，即分散液液微萃取-懸浮固化（DLLME-SOF），該技術(shù)采用的萃取劑熔點(diǎn)接近室溫且密度小于水，待其在樣品溶液中完成萃取與富集后，利用其遇冷易凝固的特性，得以方便地從水相中分離，室溫熔化后進(jìn)樣分析。跟傳統(tǒng)的萃取技術(shù)比，其具有操作簡單、樣品和有機(jī)試劑消耗量小、萃取快速以及富集效率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種簡便、環(huán)境友好型“綠色”前處理技術(shù)，目前已經(jīng)在諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。例如，采用低共熔溶劑DLLME-SOF富集水中三氯卡班和三氯生；采用1-十一醇DLLME-SOF 富集藥片和血清中的新型抗艾滋病藥 ACC007；采用自制低共熔劑DLLME-SOF富集水產(chǎn)品中3種內(nèi)分泌干擾物；以1-十二醇為萃取劑、1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚為配位劑，采用DLLME-SOF富集水中痕量鋅；采用1-十一醇 DLLME-SOF富集血清中的阿齊沙坦。
苯甲酸、山梨酸的儀器測定方法有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法以及紫外分光光度法等，而高效液相色譜法在苯甲酸、山梨酸測定方面存在儀器普及、定量準(zhǔn)確等顯著優(yōu)勢。
研究人員將渦旋輔助DLLME-SOF 用于醬油、食醋中苯甲酸和山梨酸的富集，優(yōu)化了影響萃取效率的條件，并采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，以期為食品中苯甲酸和山梨酸的日常監(jiān)控提供新的思路。
1試驗(yàn)方法
稱取樣品置于聚丙烯離心管中，用水稀釋，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為2。用1mL移液槍吸取1-十二醇，快速注入樣品溶液中，渦旋萃取，形成乳化濁液。離心，1-十二醇層呈透明液漂浮在溶液上方。將離心管置于−20℃冰箱中后取出，1-十二醇層固化成塊狀。用不銹鋼藥匙小心將其取出，置于另一支干凈的 離心管中。樣品溶液中再加入1-十二醇，用相同方法重復(fù)萃取一次。合并兩次1-十二醇層，加熱融化后，用甲醇稀釋，經(jīng)有機(jī)濾膜過濾后按照色譜條件進(jìn)行測定。如果樣品溶液中苯甲酸、山梨酸超出線性范圍，可用甲醇稀釋后測定。
2結(jié)果與討論
2.1 色譜條件的優(yōu)化
2.1.1 檢測波長
采用二極管陣列檢測器對苯甲酸和山梨酸在波長200～400nm內(nèi)進(jìn)行掃描，得到的紫外光譜圖見圖1。
由圖1可知，試驗(yàn)選擇230nm作為檢測波長。
2.1.2 流動(dòng)相
參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.28—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》，采用20 mmol·L–1乙酸銨溶液-甲醇、含2mmol·L–1甲酸的甲醇-20mmol·L–1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相體系，考察了其對苯甲酸和山梨酸的分離效果。結(jié)果表明，苯甲酸、山梨酸分離效果均較好，進(jìn)一步考察了不同體積比（80∶20，75∶25，70∶30，65∶35）的20 mmol·L–1乙酸銨溶液-甲醇混合液對待測物分離效果的影響。結(jié)果表明：隨著甲醇比例的提高，待測物的保留時(shí)間明顯縮短，但是當(dāng)20mmol·L–1乙酸銨溶液與甲醇的體積比為65∶35時(shí)，實(shí)際樣品中苯甲酸與雜峰分離不完全。為保證分離效果，縮短分析時(shí)間，試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相為體積比70∶30的20mmol·L–1 乙酸銨溶液-甲醇混合液。
2.1.3 色譜行為
按照優(yōu)化的色譜條件對苯甲酸、山梨酸質(zhì)量濃度均為10mg·L–1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定；分別采用本方法和GB 5009.28—2016中的液相色譜法對同一醬油加標(biāo)樣品（加標(biāo)量200mg·kg–1）和食醋加標(biāo)樣品（加標(biāo)量200mg·kg–1）進(jìn)行分析，所得色譜圖見圖2。
結(jié)果說明本方法凈化效果顯著提升，有效地保護(hù)了色譜柱，使定量更為準(zhǔn)確。
2.2 萃取條件的優(yōu)化
為探究最佳萃取條件，以醬油加標(biāo)樣品（加標(biāo)量200mg·kg–1）為研究對象，采用單因素法對前處理過程中的各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)條件平行試驗(yàn)3 次。
2.2.1 萃取劑
在DLLME-SOF的過程中，萃取劑的性質(zhì)是影響萃取效果的重要因素之一，要求萃取劑密度小于水，在水中溶解度小，揮發(fā)性低，熔點(diǎn)接近室溫，對目標(biāo)物有較強(qiáng)的萃取能力?；谏鲜鰲l件，分別考察了1-十一醇和1-十二醇等常用萃取劑的萃取效果。結(jié)果表明：二者萃取效率接近，但是1-十一醇部分固體破碎懸浮在液面上，收集較困難，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性較差，而1-十二醇呈完整的塊狀固體懸浮在液面上，固液分離徹底。同時(shí)，1-十二醇的熔點(diǎn)（24℃）較 1-十一醇的（19℃）高，能更快完成固化過程。因此，試驗(yàn)選擇1-十二醇作為萃取劑。
2.2.2 體系酸度
固定1-十二醇的加入量為200μL，不加氯化鈉，離心，−20℃冰箱固化，試驗(yàn)用1mol·L–1鹽酸溶液或 50％（體積分?jǐn)?shù)）氨水溶液調(diào)節(jié)體系酸度，考察了體系酸度（pH為1～5）對萃取效果的影響，結(jié)果見圖3。
結(jié)果表明，為保護(hù)色譜柱并節(jié)約試劑，試驗(yàn)選擇體系pH為2。
2.2.3 鹽效應(yīng)
加入鹽可提高樣品溶液的離子強(qiáng)度，會(huì)對目標(biāo)物的萃取效率產(chǎn)生一定的影響。隨著樣品溶液離子強(qiáng)度的增大，目標(biāo)物在水中溶解度隨之降低，從而有利于萃取。但是過多的鹽會(huì)增加溶液的黏性，降低萃取劑的性能。
固定1-十二醇的加入量為200μL，體系pH為2，離心，−20℃冰箱固化10min，試驗(yàn)考察了氯化鈉加入量（0，100，200，400，500mg）對目標(biāo)物萃取效果的影響。結(jié)果表明，苯甲酸和山梨酸的峰面積變化均不明顯。因此，試驗(yàn)選擇不加氯化鈉。
2.2.4 萃取劑用量及次數(shù)
固定體系pH為2，渦旋時(shí)間為120s，離心，−20℃冰箱固化10min，試驗(yàn)考察了1-十二醇用量（100，150，200，250，300，350μL）對萃取效果的影響，結(jié)果見圖4。
根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇萃取劑用量為 250μL，萃取次數(shù)為2次。
2.2.5 萃取方式及時(shí)間
固定體系pH為 2，萃取劑加入量為 250μL，萃取次數(shù)為2次，離心，−20℃冰箱固化10min，試驗(yàn)分別考察了渦旋和超聲兩種萃取方式對萃取效果的影響。根據(jù)結(jié)果，試驗(yàn)選擇渦旋萃取60s。
2.2.6 離心時(shí)間
為加速兩相分離，固定其他條件，離心，考察了離心時(shí)間（2～10min）對萃取效果的影響。根據(jù)結(jié)果，試驗(yàn)選擇離心時(shí)間為5min。
2.2.7 固化方式及時(shí)間
因萃取劑熔點(diǎn)接近室溫，需降溫使其固化，常用的固化方式為冰浴冷卻或−20℃冰箱冷卻。固定其他條件，分別考察了上述常用兩種固化方式的效果，結(jié)果表明：二者均能達(dá)到較好的固化效果，采用−20℃冰箱冷卻更方便，適合于大批量操作，且實(shí)驗(yàn)室普遍配備冰箱，無需另外購置制冰機(jī)。進(jìn)一步考察了冷卻時(shí)間（2～10min）對固化效果的影響，結(jié)果表明：當(dāng)冷卻時(shí)間不小于5min時(shí)，苯甲酸和山梨酸的峰面積幾乎無變化，推測1-十二醇已充分固化。因此，試驗(yàn)選擇−20℃冰箱固化5min。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限
按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以苯甲酸和山梨酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為1.0～50mg·L–1，線性參數(shù)見表1。
以3倍信噪比（S/N）確定檢出限（3S/N），10倍信噪比確定測定下限（10S/N），結(jié)果如表1所示。
2.4 精密度和回收試驗(yàn)
按照試驗(yàn)方法分析醬油和食醋實(shí)際樣品，并進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測定6次，計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表2所示。
結(jié)果表明：苯甲酸的回收率為 95.6％～102％，測定值的RSD為 2.0％～3.5％；山梨酸的回收率為95.3％～98.1％，測定值的RSD為1.7％～4.5％。說明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，適合于醬油、食醋中苯甲酸和山梨酸的測定。
2.5 樣品分析
為方便方法比較，通過查看配料表，選擇含有苯甲酸或山梨酸的樣品，按照本方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.28—2016測定醬油和食醋樣品各 3份，結(jié)果見表3。
結(jié)果顯示：所有樣品中均檢出苯甲酸或山梨酸，與配料表標(biāo)示的一致，檢出量未超過GB 2760—2014所規(guī)定的最高限量。兩種方法所得結(jié)果基本一致，說明該方法適合實(shí)際樣品的測定。
3試驗(yàn)結(jié)論
研究人員采用渦旋輔助DLLME-SOF富集醬油、食醋中的苯甲酸和山梨酸，取樣量僅為0.25g，單個(gè)樣品僅消耗500μL1-十二醇和5mL甲醇，試劑消耗量小且低毒廉價(jià)。萃取過程僅需渦旋 60s，離心5min，固化5min。與傳統(tǒng)方法相比，本方法凈化效果好，有效保護(hù)了色譜柱，顯著降低了周期和成本。后續(xù)研究可將此技術(shù)擴(kuò)展到其他食品基質(zhì)及更多種類的食品添加劑中。
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