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摘要

目的：對多肽微球注射劑進行形態(tài)分析，探討形態(tài)與釋放和工藝的關系。

方法：采用掃描電鏡分析表面形態(tài)，采用孔徑分析儀測定孔隙率，采用激光衍射粒度儀檢測粒徑及其分布，采用恒溫水浴法測定初始釋放度。

結果：測定了6種基于乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]多肽微球注射劑的表面形態(tài)、孔隙率、粒徑及其分布等形態(tài)學參數(shù)，分析了微球注射劑的表面形態(tài)對突釋效應的影響，總結了孔隙率的表征方法。

結論：表征微球注射劑形態(tài)與結構參數(shù)，可反映微球注射劑的微結構、區(qū)分不同的生產工藝與內在質量，對于評價工藝及其穩(wěn)定性與釋放度，進行微球注射劑反向工程研究具有重要的意義。

 

關鍵詞

緩釋微球; 表面形態(tài); 孔隙率; 粒徑分布; 釋放度; 微觀結構

 

對于仿制藥開發(fā)而言，仿制制劑需要與原研藥保持一致的質量和療效。目前全球范圍內僅有十余種多肽緩釋微球注射劑(以下簡稱微球)獲批上市，批準上市的仿制制劑更少?；诰廴樗?羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]的多肽緩釋微球制劑的研發(fā)和生產面臨諸多挑戰(zhàn)，主要原因在于PLGA的復雜特性、制劑設計與表征的多樣性以及監(jiān)管要求的嚴格性[1]。同時對關鍵配方和制造參數(shù)對產品性能影響的理解不足，缺少對PL GA微球微觀結構表征和內在質量的分析，以上這些因素都增加了藥物仿制和研發(fā)的難度[2]。

 

緩釋微球制劑的開發(fā)不僅需要關注藥物釋放動力學，還需優(yōu)化組成成分和制造工藝，其微觀結構是連接藥物釋放行為與工藝參數(shù)的關鍵紐帶，表面形態(tài)能夠反映配方組成和生產工藝的特點[3]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)建議對復雜藥物產品的微觀結構進行表征與比較，以證明仿制藥與參比制劑之間的質量一致性和生物等效性。因此，對微球的形態(tài)、粒徑和孔隙率等特征進行分析，不僅可以深入了解藥物釋放行為，還能優(yōu)化生產流程，確保不同批次的仿制制劑與參比制劑的質量和療效的一致性。

 

目前關于緩釋微球制劑形態(tài)分析的研究相對較少，其中孔隙率很少被表征。筆者選取幾種市售的基于PLGA的多肽緩釋微球制劑為研究對象，首次測定其孔隙率，分析其表面形態(tài)和粒徑，探討了表面形態(tài)與生產工藝和釋放的關系，旨在為緩釋微球制劑的仿制和研發(fā)提供參考。

 

1 儀器與試藥

TM-1000掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司); Pore Master GT60孔徑分析儀(美國Quantachrome公司); 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司); XP205電子天平(德國Mettler公司); Mastersizer2000激光粒度儀(英國Malvern儀器公司); MM10型恒溫水浴震蕩箱(日本Taitec公司)。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、聚山梨酯80、三乙胺和磷酸(分析純); 乙腈為色譜純; 醋酸亮丙瑞林對照品(批號: 150700-202002，中國食品藥品檢定研究院，含量89.8%)。

微球樣品信息見表1。

 

2 方法

2.1 掃描電鏡分析

取微球粉末少量，將樣品粘涂在貼有導電膠的金屬臺上，涂布均勻。使用離子鍍膜儀將微球表面鍍金，掃描電子顯微鏡(SEM)下對樣品進行觀察并拍照記錄。

2.2 粒徑分布測定

激光衍射粒度儀分析: 顆粒折射率為1.520，分散劑折射率為1.330，通用分析模式，顆粒吸收率為0.1，攪拌速度1800~2500r·min-1，超聲強度15W·m-2。待儀器準備就緒后，取微球樣品約30mg，加入100mg·mL-1聚山梨酯80溶液5mL，渦旋并形成混懸液，然后將混懸液倒入樣品池中，使遮光度在2%~5%范圍內，超聲30~60s后，平行測定3次。

2.3 孔隙率測定

孔徑分析儀參數(shù): 汞表面張力480mN/m，膨脹計體積0.5mL，汞接觸角140°，取干燥樣品0.2~0.3g，置于樣品管中測定。

2.4 初始釋放度測定

2.4.1 液相色譜條件

色譜柱: WatersXbridge Peptide BEH C18(4.6mm×150mm，3.5μm); 流動相: A相(稱取15.2g三乙胺溶解于800mL水中，用磷酸調節(jié)pH至3.0，加水稀釋至1000mL); B相: 乙腈-水=77∶23; 柱溫: 40℃; 進樣器溫度: 4℃; 檢測波長為220nm; 流速為1mL·min-1; 運行時間: 20min; 進樣體積: 30μL。

2.4.2 溶液的配制

釋放介質: 稱取十二水合磷酸氫二鈉3.7g，二水合磷酸二氫鈉1g，加水500mL使其完全溶解，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.0，加入0.1g聚山梨酯80，攪拌均勻，制成0.03mol·L-1磷酸鹽緩沖液。對照品溶液: 精密稱取醋酸亮丙瑞林對照品，加入流動相制成0.2mg·mL-1的溶液。

2.4.3 樣品測定

取醋酸亮丙瑞林微球約40mg，置于15mL玻璃瓶中，加入10mL釋放介質，用膠塞密閉，鋁蓋封蓋，使溶液混懸，將玻璃瓶靜置于恒溫水浴箱，水浴溫度為(37±1)℃，分別在0.5、4、24h取樣，每次取樣前0.5h將溶液混懸，然后靜置0.5h，精密量取上清液1mL作為供試品溶液。平行配制3份樣品，采用“2.4.1”項下條件分析。

 

3 結果

3.1 微球表面形態(tài)

掃描電鏡是評價微球表面形態(tài)的常用工具，通過低倍率的觀察，可初步了解微球的分布和整體形貌; 通過高倍率的觀察，可詳細觀察單個微球的表面結構，甚至內部結構。表面形態(tài)與微球的工藝密切相關，可通過觀察微球制劑的形態(tài)，不斷優(yōu)化工藝參數(shù)。

表面形態(tài)評價可包含以下方面: 微球的性狀(圓形、類圓形或不規(guī)則)、粗糙度(光滑或粗糙)、表面特征(有無孔隙、裂紋、凹陷)和內部結構(多孔或實心)等[4]。微球表面的光滑度或粗糙度是關鍵指標，表面光滑的微球通常具有更好的穩(wěn)定性和均勻性，而表面粗糙的微球可能更容易吸附藥物結晶，導致藥物突釋。

圖1是亮丙瑞林微球的掃描電鏡圖，圖1A、C和E為微球整體形貌圖，圖1B、D和F為單個微球放大圖。亮丙瑞林微球采用乳化揮發(fā)法制備，3種微球樣品表面存在許多孔洞，這是微球制備過程中二氯甲烷揮發(fā)而形成的，為微球中藥物的早期釋放提供了通道。在3種樣品表面均發(fā)現(xiàn)白色顆粒，推測為輔料甘露醇，周圍發(fā)現(xiàn)許多塊狀物，可能為殘留的輔料PLGA碎片。透過單個微球圖片，可見其內部為疏松多孔的網(wǎng)狀結構。此外，對比3個企業(yè)樣品，在企業(yè)C樣品中發(fā)現(xiàn)少量表面有裂痕的微球。

圖2為奧曲肽微球的掃描電鏡圖，圖2A和C為微球整體形貌圖，相比企業(yè)D微球，企業(yè)E微球粘連較多，表面有大量碎片狀輔料。圖2B和D(放大2500倍)是單個微球掃描電鏡圖，從圖2中可見企業(yè)D和E微球外觀完整，表面無裂痕，企業(yè)D微球表面較為光滑，而企業(yè)E微球表面卻存在較大、較多的孔洞，企業(yè)D和E樣品分別采用相分離法和乳化揮發(fā)法制備，工藝的差別可通過表觀形態(tài)予以區(qū)別。

圖3為帕瑞肽微球的掃描電鏡圖，由圖3A和B，可見微球呈規(guī)則球狀，微球無黏附現(xiàn)象，周圍無輔料包裹。在圖3C中可見單個破裂微球，圖3D為其放大后的內部的微觀形態(tài)，內部為多孔的網(wǎng)狀骨架。該微球采用乳化揮發(fā)法制備，混合機的混合速率、水相與有機相投料速率、空氣流速等都會影響微球的微觀形態(tài)。

圖4是乙酸曲普瑞林微球的掃描電鏡圖，圖4A和C為微球整體形貌圖，圖4B和D為單個微球放大圖。企業(yè)I和J工藝不同，可通過表面形態(tài)予以區(qū)別。圖4A為企業(yè)I的微球搗碎前形態(tài)，圖4B為搗碎后形態(tài)，由圖4A(放大400倍)可見微球隱藏在片狀結晶下，片狀結晶是輔料甘露醇凍干后形成的，微球包裹在了甘露醇中。圖4B表明搗碎后的微球呈規(guī)則球狀，表面無明顯孔隙，這是因為企業(yè)I微球采用熱熔擠出冷凍粉碎法制得。

圖4C(放大1000倍)是企業(yè)J微球掃描電鏡圖，從圖中可見企業(yè)J微球呈規(guī)則球狀。圖4D(放大2500倍)可見企業(yè)J微球表面孔洞較多，該微球采用乳化揮發(fā)法制備，制備過程中有機溶劑二氯甲烷迅速從微球內部揮發(fā)形成孔洞。

3.2 微球孔隙率

孔徑可分為微孔(<2nm)、介孔(2~50nm)和大孔(>50nm)。多孔PLGA微球的典型孔徑為大孔，可達到數(shù)微米。微球孔隙率是指孔隙的總體積占其總表觀體積的比例。通常選用壓汞法測定，通過測定液態(tài)汞進入孔隙所需的外壓，而外壓與孔徑成反比，測量不同外壓進入孔中汞的量，由此計算相應孔的大小、孔隙體積及孔隙率[5-6]。本研究選用壓汞法，測量了6種多肽緩釋微球的孔隙率，結果見表2。

對于同一廠家，3種不同規(guī)格的樣品，其孔隙率比較接近，帕瑞肽微球的孔隙率約在53%~56%，孔隙率的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為2.4%; D廠家的奧曲肽微球制劑孔隙率約為43%~45%，與文獻[7]報道結果47%比較接近，孔隙率的RSD為2.5%?？紫堵实囊恢滦砸部煞从吵鲋苽涔に嚨姆€(wěn)定性。對同一品種，不同廠家的微球樣品進行分析。采用不同工藝制備的樣品，孔隙率結果存在明顯差異。例如對于奧曲肽微球，企業(yè)D和E的工藝分別為相分離法和乳化揮發(fā)法，企業(yè)D微球孔隙率明顯低于企業(yè)E。對于曲普瑞林微球，企業(yè)I和J的工藝分別為熱熔擠壓法和乳化揮發(fā)法，企業(yè)J樣品的孔隙率明顯低于企業(yè)I樣品。對于采用相同工藝制備的樣品，不同廠家的孔隙率結果相似。對于亮丙瑞林微球而言，3家企業(yè)均采用乳化揮發(fā)法制備，孔隙率結果比較接近，在69%~74%范圍內，但是企業(yè)A顆粒內孔隙率最小，只有2.7%，低于企業(yè)B和企業(yè)C的結果。

3.3 微球粒徑及其分布

粒徑及其分布是可能影響通針性和突釋/釋放的重要參數(shù)，較大顆粒微球可能導致注射過程中針頭堵塞。其檢測方法比較成熟，通常采用激光衍射法測定。D[4，3]表示平均體積粒徑，D[3，2]表示比表面積平均粒徑，d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)用于表示粒徑分布?？缇嘁部梢杂脕碇刚髁６鹊姆植记闆r，跨距越小代表微球的粒度分布越均勻。

粒徑及其分布可反映微球制劑制備工藝的穩(wěn)定性，由表3可知，對于同一廠家、3種不同規(guī)格的樣品，微球制劑粒徑分布相似，表現(xiàn)為d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)數(shù)值接近，奧曲肽微球平均體積粒徑在50.5~52.8μm; 帕瑞肽微球平均體積粒徑在45.0~45.6μm，可反映以上2個廠家工藝比較穩(wěn)定。

此外，粒徑及其分布也可以區(qū)分不同的工藝。對于奧曲肽微球制劑，企業(yè)D微球的D[4，3]在50~53μm范圍內，企業(yè)E微球的D[4，3]在61μm左右，大于企業(yè)D微球。企業(yè)D微球的跨距明顯小于企業(yè)E微球，說明企業(yè)E微球的粒度分布范圍更寬。對于亮丙瑞林微球制劑，企業(yè)A和B樣品的粒徑及其分布相似，而企業(yè)C平均粒徑約為A和B樣品的2倍，說明企業(yè)C的工藝參數(shù)與另外2家有差異。

文獻[8]探討不同生產制備參數(shù)下的亮丙瑞林微球的質量屬性和釋放性能。研究結果表明聚合物和明膠的微小變化會影響微球的粒徑。此外，對于工藝參數(shù)而言，降低聚合物濃度、選擇低凝膠強度的明膠、提高均質化速度、減少初水相和次水相體積、延長第二次均質化時間、提高攪拌速率等方式可以減小微球粒徑; 而增加聚合物濃度、選擇高凝膠強度的明膠、降低均質化速度、增加初水相和次水相體積、縮短第二次均質化時間、降低攪拌速率等方式可以增加微球粒徑。

3.4 微球表面形態(tài)對突釋效應的影響

PLGA微球的孔隙結構顯著影響藥物的突釋現(xiàn)象?？紫堵省⒖紫洞笮『瓦B通性均起關鍵作用。高孔隙率微球表面積大，水擴散通道多，易致初期藥物快速釋放，引發(fā)突釋[9]。大孔隙提供更直接的水擴散路徑，加速藥物釋放，增加突釋風險[10]。連通孔隙結構促進水快速擴散，進一步加速藥物釋放，導致突釋。此外，孔隙結構動態(tài)可變，在藥物釋放過程中可能因聚合物降解和環(huán)境條件變化而打開或關閉，進而影響突釋行為[11]。

另外，粒徑也影響藥物釋放速率和注射性能，小粒徑微球釋放快，如果制劑中小粒徑微球分布占比高，也可能導致藥物的突釋?，F(xiàn)以注射用亮丙瑞林微球為例，說明微球形態(tài)對體外初始釋放度的影響。

由表4可見，在0.5~24h內，3家企業(yè)樣品的初始釋放度差別較大: 企業(yè)A<企業(yè)B<企業(yè)C。當初始釋放0.5h，企業(yè)C樣品的初始釋放度是企業(yè)A樣品的10倍以上，是企業(yè)B樣品的3倍以上; 在0.5~24h，企業(yè)C樣品的初始釋放度變化較小，僅增加3%; 企業(yè)B樣品變化明顯，由4.5%增加至16%; 企業(yè)A始終保持在2%左右。

綜合考慮亮丙瑞林微球樣品的微結構，3種樣品在表面形態(tài)和球內孔隙率方面差異較大。對于球內孔隙率: 企業(yè)C>企業(yè)B>企業(yè)A。在SEM觀察中，發(fā)現(xiàn)企業(yè)C的樣品中有少量表面裂痕的微球，3號樣品突釋量大可能與其較高的球內孔隙率和表面裂痕有關。此外，2號樣品突釋量高于1號樣品，推測是因為2號樣品顆粒內孔隙率更高。

 

4 討論

通過深入分析微球形態(tài)參數(shù)與生產工藝之間的關系，可以開發(fā)出多種控制微球形態(tài)和結構的策略。同時，結合先進的制備技術和新材料，可以推動微球技術的不斷創(chuàng)新和發(fā)展。這些研究不僅有助于提高微球的質量和性能，還可以為新型藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)提供理論和技術支持。

4.1 微球表面形態(tài)與工藝的關系

微球的表面形態(tài)是其制備工藝和藥物釋放行為的橋梁。通過優(yōu)化制備工藝參數(shù)，可以調控微球的表面形態(tài)，從而實現(xiàn)對藥物釋放特性的精準控制[12]。根據(jù)表面形態(tài)可以推測的藥物釋放特性[13]，但實際釋放行為還需結合體外和體內實驗驗證?，F(xiàn)以乳化揮發(fā)法為例，介紹形態(tài)與制備工藝的關系。

光滑表面: 當PLGA濃度較高或溶劑提取緩慢時形成。這種表面形態(tài)表明微球在溶劑去除過程中收縮均勻，最終固化成型。此外，若溶劑提取不完全或存在殘留水分，也可能形成光滑表面。

多孔表面: 多孔表面的形成與PLGA的相對分子質量密切相關。當相對分子質量超過100000時，微球表面容易形成孔隙。此外，溶劑提取溫度低于PLGA的玻璃化轉變溫度(Tg)時，也會導致多孔結構的形成，因為聚合物在該溫度下不夠柔韌，無法形成致密的網(wǎng)絡結構[14-15]。

裂紋表面: 干燥過程中的毛細管壓力是引起開裂表面的原因，也與PLGA相對分子質量有關，當PLGA相對分子質量較低時，微球表面更容易出現(xiàn)裂紋，因為低相對分子質量的PLGA形成的殼層較脆，無法承受毛細管壓力[13]。

褶皺表面: 褶皺的形成與溶劑快速提取導致的表面收縮有關。當PLGA濃度較高或相對分子質量較大時，微球表面更容易出現(xiàn)褶皺。

凹坑表面: 這種表面形態(tài)可能與藥物在微球表面的聚集有關。當藥物與PLGA不相容時，藥物會在溶劑去除過程中從微球表面分離，形成凹坑[16]。

島嶼狀表面: 當藥物在微球表面沉淀時，會形成島嶼狀結構。這種形態(tài)通常出現(xiàn)在藥物與PLGA相互作用較弱的情況下，藥物沉淀在微球表面形成獨立的島嶼[17]。

4.2 孔隙率與工藝的關系

孔隙率是PLGA微球制劑的關鍵特性，對藥物釋放、物理性質、穩(wěn)定性、生物利用度以及生產工藝均有顯著影響。通過優(yōu)化孔隙率，可以精確控制PLGA微球的孔隙率，從而實現(xiàn)理想的藥物釋放特性和微球性能。

孔隙率與多種工藝參數(shù)密切相關，以乳化-揮發(fā)法為例，包括乳化類型和相體積、攪拌速度、有機相溶劑、聚合物的種類和濃度、乳化劑類型和濃度、制備溫度等[11]。例如，聚合物濃度應被視為控制孔隙率和形態(tài)的一個重要參數(shù)，過高的聚合物濃度可能會阻礙孔隙的形成[18]。而聚合物的相對分子質量、端基類型等特性也會對孔隙率產生影響。已有文獻對現(xiàn)有市售微球中聚合物關鍵質量屬性進行了表征和總結[19]，在反向工程研究中應鎖定聚合物關鍵屬性與孔隙率的關聯(lián)，方能更好復刻原研微球的微結構。

溶劑的選擇和提取條件對孔隙率的影響同樣顯著。有研究發(fā)現(xiàn)使用乙酸乙酯為油相溶劑會形成空心且具有多孔外殼的結構。相反，低水溶性溶劑(如二氯甲烷)會使孔隙率降低[20]。另外，攪拌速度的增加可以促進溶劑的快速擴散，從而增加孔隙率[12]。

4.3 微球形態(tài)表征的新技術應用展望

近年來，一些新的技術應用于微球形態(tài)表征研究，如共聚焦拉曼顯微鏡(CRM)和X射線顯微鏡(XRM)，以上方法不僅可以分析微球的表面形貌，還使深入探測其內部微細結構成為可能。

CRM法是結合了拉曼光譜技術和共聚焦顯微鏡技術，具有高分辨率成像、非破壞性檢測的特點，可對微球中藥物的分布進行分析，結合熒光標記分析藥物在微球內的分布(均勻性或核殼結構)，并觀察藥物在微球制備過程中有無轉晶現(xiàn)象，以及推測釋放行為[21]。有研究制備了3批奧曲肽微球制劑，利用CRM發(fā)現(xiàn)，與另兩批樣品相比，一批微球樣品表面藥物分布較多，推測其突釋更明顯。CRM觀察和推測結果與實際釋放結果一致[22]。

XRM是一種非破壞性的三維成像技術，可從納米尺度上高效表征樣品的微觀結構，尤其適用于微球內部孔隙結構和形態(tài)的高分辨率重建?？紫堵屎涂讖綔y定常用的方法有: SEM法、壓汞法、氣體吸附法(BET法)[11]。SEM法僅能測定微球表面及局部區(qū)域的孔隙率，無法全面反映整體孔隙率。壓汞法是用于PLGA微球孔隙率測定常用方法，測量范圍(5nm~300μm)較寬，缺點是只能測定開放孔隙，封閉孔隙無法檢測。氣體吸附法用于測量孔徑在2~50nm的孔洞，通常不適用于分析典型的PLGA微球。XRM法可以確定開放孔隙和封閉孔隙，通過構建樣品的三維模型，從而得出多種信息，如孔隙體積、孔隙連通性、比表面積和孔隙表面積以及壁厚。本研究采用壓汞法測定微球制劑的孔隙率，存在封閉孔隙未被壓汞法檢出的局限，未來將采用XRM研究并驗證。

XRM方法的另一優(yōu)點: 可將三維數(shù)據(jù)轉化為計算機模型。有研究將XRM與AI圖像分析技術進行結合，通過分析不同批次微球的信號強度變化，可以快速識別由制造參數(shù)變化導致的結構差異，從而優(yōu)化生產工藝，提高產品質量[23]。該方法不僅能夠快速評估微球制劑的結構均勻性和一致性，為生產過程中的在線和離線質量控制提供新的手段，也有望為微球制劑的質量控制和生物等效性評估提供一種高效、低成本的解決方案。

綜上，表征微球形態(tài)與結構參數(shù)，可反映微球的微結構、區(qū)分不同的生產工藝與內在質量，對于評價工藝及其穩(wěn)定性具有指導作用，對提升微球注射劑反向工程研究的效率具有重要的意義。