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各國藥典及指導(dǎo)原則中對溶出方法的驗證有一定的規(guī)定，但一個完整的溶出方法通常包含兩個步驟，即“溶出步驟”（藥物從制劑中釋放及樣品的制備過程）與“分析測定”（對已溶解分析物進行定量的過程）兩個關(guān)鍵階段，兩個階段都需分別進行相關(guān)的驗證工作，且基于這兩個階段的性質(zhì)不同，驗證工作的側(cè)重點也有所區(qū)別?；诖?，筆者結(jié)合各國藥典及指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定，梳理出了一份詳細的溶出方法驗證的操作手冊。

1.概述

在進行溶出方法的驗證的時候，需要進行“溶出步驟”和“分析測定”兩個階段的驗證，驗證研究應(yīng)該涵蓋溶出曲線中的所有時間點，對于多成分的復(fù)方制劑，也需要為每種成分分別開發(fā)并進行驗證。在進行方法驗證之前，要求濾膜吸附和玻璃吸附評估必須是滿足相關(guān)要求。

2.分析測定階段的驗證

分析測定階段的驗證需要全面考察其專屬性、線性、準(zhǔn)確度/回收率、耐用性等指標(biāo)。

2.1專屬性

專屬性的驗證需要證明溶出的結(jié)果不會受到非分析物成分的干擾，包括溶出介質(zhì)空白，輔料成分（賦形劑、涂層、油墨及膠殼等），非目標(biāo)物的其他活性成分（針對多組分的制劑）以及潛在的降解雜質(zhì)。

（1）測定方法

①輔料、非目標(biāo)物的活性成分及潛在降解雜質(zhì)干擾排查：稱取不含活性藥物的輔料混合物，將其溶解或分散在溶出介質(zhì)中，并加入已知量的藥物對照品。將此“加標(biāo)輔料溶液”與預(yù)期濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行對比測定，通過比較兩者的響應(yīng)值（如吸光度）來量化干擾程度。②空白介質(zhì)干擾排查：去不含樣品的純?nèi)艹鼋橘|(zhì)，按照與供試品相同的方法進行處理。

（2）可接受標(biāo)準(zhǔn)

輔料干擾、其他藥物成分或降解產(chǎn)物的干擾總計不應(yīng)超過2%?？瞻捉橘|(zhì)的干擾通常不應(yīng)超過1%。對于緩釋制劑，建議使用完整的輔料骨架（而非簡單的混合物）進行驗證，因為輔料會隨時間釋放，應(yīng)在多個取樣點評估干擾，通常在較晚的取樣點會出現(xiàn)最嚴(yán)重的干擾。如果輔料干擾超過2%，可以對方法進行修改，例如選擇另一個合適的分析波長（紫外方法），對吸光度值進行處理（如使用一階導(dǎo)數(shù)，紫外方法）或者選擇更具有專屬性的分析方法（如HPLC法）。

2.2線性與范圍

范圍是指藥物濃度的上限與下限之間的區(qū)間（包括上下限），在此區(qū)間內(nèi)，該分析方法已經(jīng)被證明具有合格的精密度、準(zhǔn)確度和線性。如果是溶出度，下限可以做到限度（Q值）—45%，上限可以做到最高規(guī)格標(biāo)示量的130%；如果是溶出曲線，下限可以做到定量限，上限可做到最高規(guī)格標(biāo)示量的130%。

（1）測定方法

建立線性時，所準(zhǔn)備的藥物溶液濃度應(yīng)涵蓋從低于預(yù)期濃度到高于預(yù)期最高釋放濃度的完整區(qū)間?？梢圆捎脤φ掌啡芤?、加標(biāo)空白輔料溶液或者標(biāo)準(zhǔn)加入法來制備線性考察的樣品。通常要求至少5個濃度點。建議盡可能從同一個母液進行稀釋配制，且濃度范圍不得超過分析方法或者儀器的線性極限。為了增加難溶性藥物的溶解度，可以加入有機溶劑，但一般情況下，最終溶液中有機溶劑的比例不得超過5%（V/V）。

（2）數(shù)據(jù)統(tǒng)計與判定標(biāo)準(zhǔn)

通常使用最小二乘回歸方法對數(shù)據(jù)進行處理。要求線性方程相關(guān)系數(shù)的平方（r2）通常應(yīng)≥0.98，回歸方程的y-軸截距不能與零有顯著性差異。

2.3準(zhǔn)確度/回收率

（1）測定方法

通過配制包含藥物成分及所有輔料成分（如助劑、包衣材料、膠囊殼等）的多濃度樣品溶液來進行驗證，所配制的濃度應(yīng)涵蓋從預(yù)期最低濃度到預(yù)期最高濃度的區(qū)間。準(zhǔn)確度的驗證可以和線性的驗證相結(jié)合，也可以采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進行。注意：在進行準(zhǔn)確度的驗證之前，必須已經(jīng)完成了濾膜吸附的相關(guān)研究，排除濾膜及玻璃儀器對于目標(biāo)物質(zhì)的吸附干擾。與線性一樣，為了增加難溶性藥物的溶解度，可以在配制母液的時候加入少量的有機溶劑幫助溶解，但最終溶液中，有機溶劑的加入量不得過5%，并且不能干擾分析。對于極低劑量的制劑，建議使用母液直接稀釋，而不是采用直接稱量極其微量的固體粉末，可以減少稱量誤差。

（2）可接受標(biāo)準(zhǔn)

測得的加樣回收率通常應(yīng)該在95%~105%的范圍內(nèi)。對于不同規(guī)格的系列產(chǎn)品，可以采用括號法或者矩陣法進行驗證。

（3）特殊情況

對于在酸性介質(zhì)溶解度極低的藥物，回收率試驗可能非常具有挑戰(zhàn)性，可能需要根據(jù)具體情況具體分析。如果藥物在酸性介質(zhì)中會降解，必須使用降解產(chǎn)物來定量計算已溶解的藥物量。驗證實驗必須涵蓋這一計算過程。

2.4重復(fù)性

（1）測試方法

通過對加標(biāo)輔料溶液、1個已溶出的片劑所產(chǎn)生的均質(zhì)樣品或采用標(biāo)準(zhǔn)加入法制備的溶液進行重復(fù)測量來評估。①方案一：在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少進行9次測定（例如：3個濃度點，每個濃度點重復(fù)3次）。②方案二：在100%的測試濃度下，至少進行6次測定。

（2）可接受標(biāo)準(zhǔn)

通常計算多次進樣或分光光度計讀數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。也可以利用線性或準(zhǔn)確度實驗中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行計算。一般要求樣品的RSD不得過2%。

2.5中間精密度

中間精密度旨在確定隨機事件（如不同日期、不同分析人員）對溶出結(jié)果精密度的影響?？梢圆捎脤嶒灳仃囋O(shè)計，相對于單變量實驗，矩陣設(shè)計能更清晰地觀察到各個因素之間的相互作用。典型的研究變量包括不同的日期、分析人員及設(shè)備。具體的測試方法和可接受標(biāo)準(zhǔn)可以參見重復(fù)性項下。

2.6重現(xiàn)性

重現(xiàn)性要求至少在兩個不同的實驗室的兩個人進行相應(yīng)的實驗。主要是采用加標(biāo)空白輔料溶液、1個已溶出的片劑所產(chǎn)生的均質(zhì)樣品或標(biāo)準(zhǔn)加入法制備的樣品溶液進行分析，其具體的操作和可接受標(biāo)準(zhǔn)可以與中間精密度一致。

2.7耐用性

耐用性是用于評估故意改變?nèi)艹鰲l件或者檢測條件對于測定結(jié)果的影響的指標(biāo)，通常在方法開發(fā)的后期進行，ICHQ2中也提到耐用性可以不用在方法驗證的階段進行，但是也是我們需要在驗證時進行評估的一個指標(biāo)。

（1）操作步驟

對檢測條件進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，例如對于HPLC的方法，調(diào)整流動相組成（有機相比例、緩沖液濃度、pH）、流速、波長、柱溫、不同色譜柱（同型號不同序列號等）；對于UV的方法，可以對檢測波長進行微調(diào)。采用加標(biāo)空白輔料溶液在修改的條件下進行測定，與正常條件的測定結(jié)果進行對比。

（2）可接受標(biāo)注

評估正常條件下與修改之后的條件測定的結(jié)果的RSD，應(yīng)不得過2%；或者評估正常條條件與修改之后的條件下的測定結(jié)果的差值，應(yīng)不得過±2%。

3.“溶出步驟”的驗證

溶出步驟的驗證重點在于評估樣品制備過程中的精密度和耐用性。

3.1重復(fù)性

（1）測試方法

與分析過程中的重復(fù)性不同，溶出步驟驗證過程中的重復(fù)性需要采用性狀優(yōu)良的制劑或等效的混合物，對多個獨立的單位（如6片或12片）分別進行溶出實驗，以證明溶出過程本身的可重復(fù)性。如果是溶出曲線研究，需要對曲線上的各個點都進行取樣測定。

（2）可接受標(biāo)準(zhǔn)

對于相同規(guī)格的產(chǎn)品，溶出結(jié)果的差異應(yīng)滿足：當(dāng)溶出量<85%時，各結(jié)果的絕對差異不超過10%。當(dāng)溶出量≥85%時，各結(jié)果的絕對差異不超過5%。當(dāng)然，可接受標(biāo)準(zhǔn)也可以根據(jù)特定產(chǎn)品進行調(diào)整，在說明其合理性的前提下，可使用其他的統(tǒng)計測試和限度。

3.2中間精密度

溶出步驟階段的中間精密度也可與分析過程的中間精密度一致，可以采用矩陣法設(shè)計其考察因素。與分析檢測階段不一致的是，我們需要采用性狀優(yōu)良的制劑進行，如果沒有對應(yīng)的制劑，也可以使用加入藥物活性物質(zhì)的預(yù)稱量輔料（加標(biāo)輔料）來研究中間精密度，這也有助于評估分析測定階段對結(jié)果變異的貢獻。

（1）測試方法

多人員對比：至少由同一實驗室的兩名分析人員獨立進行實驗。獨立準(zhǔn)備：每位人員需獨立制備對照品溶液、介質(zhì)，并遵循預(yù)先設(shè)好的取樣方法和定量方法。設(shè)備差異：分析人員通常應(yīng)使用不同的溶出儀、分光光度計或HPLC設(shè)備（包括色譜柱）以及自動取樣器，并在不同日期進行測試。規(guī)格涵蓋：驗證應(yīng)涵蓋產(chǎn)品的全量程范圍。在不必要對每個規(guī)格進行驗證時，可以采用括號法，即僅驗證最高和最低規(guī)格。

（2）可接受標(biāo)準(zhǔn)

對于相同規(guī)格的產(chǎn)品，在任意兩個實驗條件下的溶出均值差異應(yīng)滿足：當(dāng)溶出量<85%時，絕對差異不超過10%。當(dāng)溶出量≥85%時，絕對差異不超過5%。當(dāng)然，可接受標(biāo)準(zhǔn)也可以根據(jù)特定產(chǎn)品進行調(diào)整，在說明其合理性的前提下，可使用其他的統(tǒng)計測試和限度。

3.3重現(xiàn)性

也分析階段一致，如果需要開展重現(xiàn)性研究，就需要兩個實驗室的不同人之間開展對應(yīng)的實驗。重現(xiàn)性是保證溶出方法在不同實驗室轉(zhuǎn)移成功的關(guān)鍵。需要性能優(yōu)良的制劑進行驗證，其具體的測試方法和可接受方法可以參考中間精密度項下。

3.4耐用性

也可以在方法開發(fā)的后期進行，但是也是方法驗證中的一個重要的評估指標(biāo)。

（1）測試方法

對溶出步驟的條件進行調(diào)整，例如介質(zhì)的組成（如緩沖液濃度、表面活性劑濃度、pH值、脫氣程度）或物理參數(shù)（介質(zhì)體積、攪拌速度（轉(zhuǎn)速）、取樣時間、溫度）。采用一批性能優(yōu)良的制劑進行測試。在每個條件下的測試片數(shù)可以是3片或者6片（具體的片子數(shù)量可以根據(jù)中間精密度的結(jié)果進行評估，如果中間精密度的結(jié)果顯示其變異性比較低，可以選擇3片；如果中間精密度的結(jié)果顯示其變異性比較高，可以選6片。）對耐用性進行驗證的時候，需要評估其溶出曲線上的所有取樣點。

（2）可接受標(biāo)準(zhǔn)

對于相同規(guī)格的產(chǎn)品，在任意兩個實驗條件下的溶出均值差異應(yīng)滿足：當(dāng)溶出量<85%時，絕對差異不超過10%。當(dāng)溶出量≥85%時，絕對差異不超過5%。當(dāng)然，可接受標(biāo)準(zhǔn)也可以根據(jù)特定產(chǎn)品進行調(diào)整，在說明其合理性的前提下，可使用其他的統(tǒng)計測試和限度。耐用性驗證是為了確認(rèn)溶出方法在日常實驗室操作中（面對微小的環(huán)境或操作波動時）的可靠性，其產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可以有助于確定方法中各項參數(shù)必須控制的范圍。