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目前常用的細(xì)胞毒性測(cè)定方法有MTT法和CCK-8法，相較于MTT法，cck-8法具有無(wú)毒性、效率高等優(yōu)點(diǎn)而被廣為使用。今天介紹一下cck-8法的實(shí)驗(yàn)步驟及操作技巧。

 

CCK-8法的原理

 

CCK-8全稱(chēng)Cell Counting Kit-8，是一種基于WST-8的應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)試劑盒。其工作原理為在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8這一物質(zhì)可以被線(xiàn)粒體脫氫酶還原成橙黃色的甲臜產(chǎn)物，且其顏色深淺與細(xì)胞增殖程度成正比，與細(xì)胞毒性程度成反比。

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

1）制備細(xì)胞懸液：若為懸浮細(xì)胞則直接離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞；若為貼壁細(xì)胞則用胰酶消化后離心收集細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞用含血清培養(yǎng)基重懸后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再稀釋為5×10^3~5×10^4個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。

 

2）在96孔板中接種細(xì)胞懸液，每孔100μl，同時(shí)設(shè)計(jì)不同的濃度組，每個(gè)濃度組可設(shè)計(jì)3~6個(gè)復(fù)孔，且設(shè)置好空白組和對(duì)照組。

 

3）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h左右（37℃, 5%CO2）。

 

4）向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的待測(cè)物質(zhì)（藥物、化學(xué)試劑等）放入培養(yǎng)箱中孵育6~96h。

 

6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，加完試劑后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以幫助混勻（防止因CCK8試劑沾在孔壁上而帶來(lái)的誤差），加樣的過(guò)程中盡量不要產(chǎn)生氣泡，以免影響OD值讀數(shù)。

 

7）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h。

 

8）用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度（OD）。

 

 

注意事項(xiàng)

 

（1）接種細(xì)胞數(shù)：針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)96孔板，貼壁細(xì)胞的最小接種量為1000個(gè)/孔 (100μl培養(yǎng)基)。若為白細(xì)胞，接種量不低于2500個(gè)/孔 (100μl培養(yǎng)基)。若使用24孔板或6孔板，應(yīng)預(yù)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

 

（2）在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測(cè)定450nm的吸光度作為空白對(duì)照。

 

（3）在培養(yǎng)箱中孵育期間，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，造成體積不準(zhǔn)確，從而增加誤差，因此，建議最外一圈的孔只加PBS，不作為測(cè)定孔用。

 

（4）加入待測(cè)物之后培養(yǎng)的具體時(shí)間6~96h要看待測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，例如6、12、24、48h。實(shí)驗(yàn)時(shí)可以選擇不同作用時(shí)間下進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。

 

（5）如果待檢測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性，在加入CCK-8之前要更換新鮮培養(yǎng)基，以去掉待測(cè)物質(zhì)的影響。如果影響比較小或者沒(méi)有影響，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

 

（6）正常顯色時(shí)間為1-4h，可以每半小時(shí)測(cè)定一次OD值，使其OD值保持在1-2之間后固定顯色時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

 

（7）因?yàn)榧?xì)胞種類(lèi)不同，形成的formazan的量也不一樣，所以如果顯色不夠的話(huà)，可以延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，特別是血液細(xì)胞需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6h）。

 

（8）測(cè)定波長(zhǎng)：如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm，建議選650nm。

 

（9）若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室溫避光保存， 24h內(nèi)測(cè)定OD值不會(huì)發(fā)生變化。

 

（10）新鮮的CCK-8試劑為粉紅色，儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則顏色加深、效率變低，最好不使用。通常情況下CCK-8試劑在0-5℃避光條件下可保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。

 

常見(jiàn)問(wèn)題

 

為什么復(fù)孔之間的重復(fù)性不好？

 

（1）可能在接種細(xì)胞時(shí)不小心帶入了氣泡。為避免這種情況，應(yīng)及時(shí)更換槍頭，且沿著側(cè)壁將細(xì)胞懸液加入96孔板中，避免槍尖在打液的過(guò)程中插入液面下方從而產(chǎn)生氣泡。若已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，可用1ml注射器針頭燒熱后將氣泡戳破減小誤差。

 

（2）可能是在換液過(guò)程中將貼壁的細(xì)胞滑散了。為避免這種情況請(qǐng)?jiān)诩?xì)胞貼壁后注意沿側(cè)壁底面利用槍頭的虹吸作用將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸取出來(lái)。

 

（3）可能是在換液過(guò)程種沒(méi)有將孔內(nèi)的液體洗凈就加入了新的培養(yǎng)基。

 

（4）可能是加入的CCK-8試劑微量沒(méi)有加準(zhǔn)。為避免這種情況，可以直接配制含10% CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入96孔板中，每孔100μl。

 

計(jì)算方法

 

細(xì)胞抑制率 =（對(duì)照-實(shí)驗(yàn)）/（對(duì)照-空白）×100%

 

對(duì)照：具有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8的孔的OD值

 

實(shí)驗(yàn)：具有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8和藥物溶液的孔的OD值

 

空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8的孔的OD值