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新型冠狀病毒（2019-nCoV）屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約為60~140nm。具有5個必需基因，分別針對核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）4種結(jié)構(gòu)蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因組構(gòu)成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。

實驗室檢查包括一般檢查，病原學及血清學檢查，胸部影像學檢查等。病原學檢查又包括核酸檢測和抗原檢測。

本文適用于以抗原抗體反應為原理，對鼻拭子、咽拭子、鼻咽拭子等上呼吸道樣本中的新型冠狀病毒(2019-nCoV )抗原進行體外定性的檢測試劑的研發(fā)。

新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測試劑盒（膠體金法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

 

一. 新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測試劑研發(fā)實驗要求

 

1. 分析性能研究

開發(fā)人應采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行所有分析性能研究，確定具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細內(nèi)容。

如產(chǎn)品適用不同的機型，需要開展在不同機型上進行評估的研究。如產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進行分析或驗證。對于不同的樣本類型應分別開展相應的分析性能評估研究。配套的不同保存液或裂解液至少應進行檢出限、精密度、包容性、干擾研究。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的新型冠狀病毒樣本，應采用合理方法對樣本進行標定，包括拷貝數(shù)、Ct值、TCID₅₀值等。分析性能評估用樣本應為真實樣本或病毒培養(yǎng)物，如需稀釋應采用陰性基質(zhì)進行稀釋。

建議著重對以下分析性能進行研究：

1.1、樣本穩(wěn)定性

應充分考慮實際使用過程中樣本采集、處理、運輸及保存等各個階段的條件，對不同類型樣本的穩(wěn)定性分別進行研究。內(nèi)容包括建議的保存條件、保存液、裂解液和運輸條件（如涉及）等。如樣本采集后需加入保存液、裂解液等，應同時對處理后的樣本進行樣本穩(wěn)定性的研究。建議對不同的滅活方式進行驗證。

1.2、 適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型。

1.3 、精密度

應對精密度指標，如標準差或變異系數(shù)等的評價標準做出合理要求。

應考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進行評價。

設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，具體方案可參考性能評價相關文件進行。

用于精密度評價的臨床樣本應至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、（中或強）陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設定適當?shù)木芏纫螅?/span>

①陰性樣本：待測物濃度低于檢出限或為零濃度，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

②臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應≥95%（n≥20）。

③中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）,或條帶結(jié)果顯色均一。

1.4 、包容性

使用具有時間和區(qū)域特征性的不同來源的至少10例樣本進行驗證，驗證內(nèi)容應包括重復性、檢出限等，提供樣本及濃度的確認方法、試驗數(shù)據(jù)。樣本應覆蓋目前國內(nèi)變異株的常見類型，以考察對不同變異株的檢出能力。

1.5、 檢出限

1.5.1、檢出限的確定

建議對病毒進行梯度稀釋后研究確定檢出限，每個梯度的病毒稀釋液重復3～5份，每份稀釋液重復檢測不少于20次，將具有95%陽性檢出率的病毒水平作為檢出限。

應分別選擇不同來源具有代表性的3個樣本進行檢出限的確定。

1.5.2、檢出限的驗證

選擇具有時間和區(qū)域特征性的至少3個樣本（與檢出限確定不同樣本）在檢出限濃度水平進行驗證，應達到95%陽性檢出率。

應提供詳細的病毒滴度的確定方法，同時應詳細描述病毒樣本的確認方法及驗證結(jié)果。

1.6、 分析特異性

1.6.1、交叉反應驗證

地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）；SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒。

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，呼吸道合胞病毒A、B型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸病毒A、B、C、D組，EB病毒、麻疹病毒、人巨細胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人偏肺病毒。

肺炎支原體、肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌。

驗證不少于20份正常人樣本。

除SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒可采用重組蛋白外，各病原體均應采用臨床樣本或培養(yǎng)物進行驗證。提供所有用于交叉反應驗證的病原體樣本的來源、陰陽性、種屬/型別和濃度/滴度確認等試驗資料。建議在病原體的醫(yī)學相關水平進行交叉反應的驗證，如病毒濃度為10⁵ pfu/mL或更高。

1.6.2、內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾

建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，在病毒抗原臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。

 

表1 用于干擾試驗的物質(zhì)

物質(zhì)	活性成分
粘蛋白	純化粘蛋白
血液	/
抗病毒藥物	α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋、阿比多爾
抗生素	左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、美羅培南
全身性抗菌藥	妥布霉素
過敏性癥狀緩解藥物	鹽酸組胺
鼻腔噴霧劑或滴鼻劑	苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）
鼻用皮膚類固醇	倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、    布地奈德、莫米松、氟替卡松

 

1.7 、高劑量鉤狀效應

應評估高劑量鉤狀效應并開展研究。

1.8、根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗。

1.9 、反應體系

1.9.1、反應條件確定：開發(fā)人應考慮反應時間、判讀時間、反應溫度、洗滌液體積和洗滌次數(shù)（如涉及）等條件對產(chǎn)品性能的影響，通過試驗確定上述條件的最佳組合。

1.9.2、反應體系中樣本加樣方式及加樣量確定：通過試驗確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進行處理后方可用于最終檢測，還應對樣本稀釋液及其用量、其他必要的處理方法等進行研究。

1.9.3、采樣拭子及樣本保存液的選擇：對拭子頭和拭子桿的材質(zhì)要求。明確保存液或裂解液的成分、濃度、使用量的要求等。

 

2. 穩(wěn)定性研究

穩(wěn)定性研究主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶（開封）穩(wěn)定性、高溫加速破壞穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性等，開發(fā)人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。對于實時穩(wěn)定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究。

 

3. 陽性判斷值研究

開展對申報試劑陰性/灰區(qū)/陽性等結(jié)果判斷的陽性判斷值（cut-off,CO）確定的研究。建立陽性判斷值使用的樣本來源的選擇應考慮到不同的地理區(qū)域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素的影響。如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對所有樣本類型進行陽性判斷值的驗證。

如適用，可采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的分析方式來選擇確定合理的陽性判斷值；如結(jié)果存在灰區(qū)（equivocal zone），應明確灰區(qū)建立的基礎。如采用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應說明這種方法的合理性。

 

4. 其他研究

4.1、主要原材料研究

此產(chǎn)品的主要原材料包括抗體、質(zhì)控品（線）、參考品等。應對主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標準等相關開展研究。如主要原材料為企業(yè)自制，應明確其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應明確選擇該原材料的依據(jù)及開展對比篩選試驗、供應商提供的質(zhì)量標準、出廠檢驗報告，以及檢驗該原材料到貨后的質(zhì)量，供應商應固定，不得隨意更換。

4.1.1、新型冠狀病毒特異的抗體

病原體特異的抗體是該類產(chǎn)品的關鍵原材料。在選擇抗體原料時，應注重結(jié)合表位的選擇，避免毒株間差異造成的假陰性，亦應考慮抗原在其他冠狀病毒的表達情況，避免存在交叉反應出現(xiàn)假陽性。

應開展抗體來源、制備、篩選、鑒定及質(zhì)量標準（外觀、蛋白濃度、純度、分子量、效價、功能性試驗等）等試驗。

自制抗體，如使用天然抗原作為免疫原，應明確該天然抗原的來源；如使用重組抗原或其他人工合成抗原作為免疫原，應明確相應的核酸或者蛋白序列信息。針對抗體的制備、鑒定等過程，應開展詳細的研究和工藝穩(wěn)定性驗證。

外購抗體，應詳述抗體的名稱及生物學來源，供應商名稱；開展供應商選擇的研究及供應商出具的抗體性能指標及檢驗報告。

4.1.2、其他主要原材料

除上述主要原材料外，產(chǎn)品中包含的其他主要原材料，如二級抗體、膠體金、發(fā)光物、硝酸纖維素膜、微孔板、樣本稀釋液、提取液等，均應進行選擇及驗證。明確供應商和質(zhì)量控制標準。

4.1.3、試劑盒質(zhì)控品/質(zhì)控線

產(chǎn)品應設置合理的質(zhì)控品/質(zhì)控線。質(zhì)控品應至少包含陰性和陽性兩個水平。對相關原料的來源、選擇和性能確認等相關內(nèi)容開展研究，明確供應商和質(zhì)量控制標準。開發(fā)人應對質(zhì)控品的檢測結(jié)果做出明確的范圍要求（試驗有效性的判斷）。

4.1.4、企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復性參考品。應根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設置企業(yè)參考品。

應明確企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度/滴度確認方法或試劑等相關驗證。企業(yè)參考品應采用臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)液加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設置建議如下：

4.1.4.1、陽性參考品

陽性參考品應考慮覆蓋不同來源及特征的樣本，可選擇至少各5份確認為陽性的樣本，并設置不同滴度水平。

4.1.4.2、陰性參考品

陰性參考品應考慮檢測特異性的評價，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、流感病毒、腸道病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等抗原陽性樣本。

4.1.4.3、檢出限參考品

可設置系列稀釋樣本，其中應包含檢出限水平。

4.1.4.4、重復性參考品

建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應為檢出限附近的濃度。

4.2、生產(chǎn)工藝的研究

4.1.1、明確產(chǎn)品基本反應原理。

4.1.2、明確主要生產(chǎn)工藝的依據(jù)。

4.1.3、應考慮如包被/標記液量、濃度、時間、條件等指標對產(chǎn)品性能的影響，通過試驗確定上述指標的最佳組合。

4.1.4、顯色系統(tǒng)、酶作用底物等的介紹以及最適條件研究。