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摘要

 

在QbD理念下進(jìn)行分析方法的開發(fā)與設(shè)計，應(yīng)當(dāng)評估基于檢測結(jié)果的做出錯誤決策的風(fēng)險水平，即對分析方法檢測結(jié)果的誤差進(jìn)行系統(tǒng)的設(shè)計。

一、概念誤差解析

 

誤差為測量值與真實值之差。按照誤差的性質(zhì)與特點，誤差可分為隨機(jī)誤差、系統(tǒng)誤差、粗大誤差三大類。

 

隨機(jī)誤差：在同一測量條件下，多次重復(fù)測量同一量值時，測量誤差的絕對值與正負(fù)符合以不可預(yù)知的方式變化。

 

系統(tǒng)誤差：在同一測量條件下，多次重復(fù)測量同一量值時，測量誤差的絕對值與正負(fù)符合都保持不變，或在測量條件改變時按一定規(guī)律變化。

 

粗大誤差：由于測量者的粗心大意，或者環(huán)境的突然變化而引起^【1】。

二、分析方法的誤差設(shè)計概述

 

作為分析方法質(zhì)量的一個環(huán)節(jié)，誤差的設(shè)計同樣適用質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）的相關(guān)理念，如質(zhì)量風(fēng)險管理、設(shè)計空間、生命周期。對于分析方法的質(zhì)量來說，檢測結(jié)果的誤差是一個潛在的風(fēng)險，應(yīng)當(dāng)對誤差允許的范圍（即誤差的設(shè)計空間）、分析方法的全生命周期的誤差的來源及程度進(jìn)行評估，尤其是對于精度要求高的檢測項目，如含量測定。

 

分析方法的誤差有多個來源于，包括隨機(jī)誤差、系統(tǒng)誤差、粗大誤差。在設(shè)計分析方法的誤差時，應(yīng)當(dāng)首先根據(jù)外部要求確定該方法允許的誤差限度，然后根據(jù)誤差的合成與分配原理，制定對不同來源誤差的可接受限度。根據(jù)在方法開發(fā)過程中對方法性能的理解，決定使用先驗知識或統(tǒng)計學(xué)理論、工具對方法誤差進(jìn)行評價。在對不同來源的誤差進(jìn)行風(fēng)險分析時，可根據(jù)對外部要求與方法性能的理解，決定采用定性分析或者定量分析或者二者結(jié)合的方式。

 

在方法開發(fā)過程中，應(yīng)當(dāng)對方法的誤差進(jìn)行系統(tǒng)的風(fēng)險評估，并根據(jù)評估的結(jié)果決定是否以及如何優(yōu)化分析方法的相關(guān)參數(shù)。

 

對分析方法誤差的研究結(jié)論應(yīng)當(dāng)作為分析方法相關(guān)知識的一部分整合到分析方法的知識庫中，按照實驗室的知識管理相關(guān)規(guī)定，根據(jù)需要進(jìn)行共享，以支持分析方法生命周期其他階段的活動，如方法驗證、方法轉(zhuǎn)移、日常監(jiān)測以及方法變更等。在分析方法的全生命周期中，需及時根據(jù)最新的研究成果更新誤差的知識。

 

例1：如何根據(jù)外部要求確定方法允許的誤差

 

某原料藥的含量測定可接受標(biāo)準(zhǔn)為98.0%~102.0%，多批次實際檢測結(jié)果為99.0%~100.5%。方法允許的誤差為（99.0%-98.0%=1.0%，102.0%-100.5%=1.5%；二者取小值）1.0%。

三、分析方法的隨機(jī)誤差

 

分析方法的隨機(jī)誤差有多個來源，如儀器的響應(yīng)、樣本屬性、樣品制備過程等。在進(jìn)行方法的誤差設(shè)計時，需要評估隨機(jī)誤差的風(fēng)險。如隨機(jī)誤差超過了允許的范圍，首先可以選擇優(yōu)化方法的參數(shù)，使誤差減輕至可接受的程度，也可以通過多次測定取均值的方式減輕，但是增加測定次數(shù)可能導(dǎo)致分析時間及成本的大幅上升。復(fù)測的要求應(yīng)當(dāng)在分析方法中明確規(guī)定。

 

例2：儀器響應(yīng)誤差的評估（HPLC）

 

儀器響應(yīng)對于分析方法多數(shù)情況下是一個隨機(jī)誤差，需要評估是否超過允許的范圍。如例1的原料藥含量測定，假設(shè)經(jīng)過誤差的分配，1%的總誤差分配的進(jìn)樣允許誤差為0.5%，則需評估連續(xù)進(jìn)樣的RSD?？梢允褂媒y(tǒng)計學(xué)的原理對其進(jìn)行定量的分析，其計算公式如下^*1：

其中E為允許的誤差；Z為特定置信水平下的Z值，為一常數(shù)；n為連續(xù)進(jìn)樣的次數(shù)。如期望95%^*2的概率（Z值為1.96）單次進(jìn)樣的檢測結(jié)果不超過允許的誤差限度0.5%，將Z=1.96，E=0.5%，n=1分別代入公式，得出連續(xù)進(jìn)樣RSD = 0.25%。即該方法儀器響應(yīng)的RSD不得過0.25%。

 

如果儀器響應(yīng)的RSD已經(jīng)優(yōu)化至不能減輕，則需要評估是否需要多次進(jìn)樣分析，其計算公式如下：

其中σ為連續(xù)進(jìn)樣的標(biāo)準(zhǔn)差。假設(shè)連續(xù)進(jìn)樣的RSD為1%，欲使檢測結(jié)果的誤差在95%的概率上不超過允許的誤差，將Z=1.96，E=0.5%，σ=1%分別代入公式，得出平行進(jìn)樣的次數(shù)為15.4（修約至16）。即在規(guī)定條件下該方法需平行測定16次取均值，才能滿足誤差的要求。

 

*1:該計算公式源于置信區(qū)間計算公式的變形。

*2：是統(tǒng)計學(xué)上的置信水平的概念，在方法開發(fā)時置信水平可以適當(dāng)調(diào)整，但應(yīng)當(dāng)作為分析方法知識的一部分記錄入知識庫中。

 

樣本屬性的誤差評估

 

由于成本以及技術(shù)上的可行性等因素的限制，檢測在大多數(shù)情況下是用樣本屬性評估總體屬性，即在實踐中一般是使用抽樣檢測的方式評價產(chǎn)品質(zhì)量。抽樣檢測必然要求樣本的屬性在一定程度上能代表總體屬性，但是如果總體中的個體之間屬性存在差異，則需評估樣本屬性誤差的風(fēng)險。

 

一般來說樣本容量越接近總體時，其屬性越接近總體屬性，即檢測結(jié)果誤差越?。坏怯捎诮?jīng)濟(jì)與可行性等因素的制約，樣本容量一般不宜過大。

 

在設(shè)計分析方法樣本屬性的誤差時，由于不能改變樣本中個體屬性之間的差異，只能通過調(diào)整樣本量的方式來控制檢測結(jié)果的誤差不超過誤差設(shè)計時被分配的限度。樣本量的計算方法同例2中的進(jìn)樣次數(shù)，公式中σ為個體間屬性的標(biāo)準(zhǔn)差。

 

原料藥大多情況下可以認(rèn)為是均勻的樣品，樣本屬性的誤差風(fēng)險較小；而制劑如片劑、膠囊等個體間的屬性存在差異，尤其是在含量測定、溶出度等檢測項目中，在進(jìn)行相關(guān)方法的開發(fā)時，應(yīng)當(dāng)評估樣本容量的風(fēng)險。

 

樣品制備過程

 

樣品制備過程中，可能會用到稱量、溶解、移液、萃取、過濾、衍生化等操作，這些操作都會增加檢測結(jié)果誤差的風(fēng)險。對于稱量、溶解、移液等操作，可以通過評估稱量值、容量瓶體積、量取體積等評估相應(yīng)過程的誤差；而對于萃取、衍生化等高風(fēng)險操作，必要時可以通過多次檢測平行樣品的方式評價誤差的水平，以確認(rèn)是否需要多次制備樣品。樣品制備次數(shù)的計算方法同例2中的進(jìn)樣次數(shù)，公式中σ為平行樣品間檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差。

四、分析方法的系統(tǒng)誤差

 

分析方法中存在多個系統(tǒng)誤差來源，主要分為兩類，是與分析方法無關(guān)的或者有關(guān)的。對照品含量、量具等來源的與分析方法無關(guān)的系統(tǒng)誤差，在分析方法開發(fā)過程中無法優(yōu)化，主要有實驗室的對照品標(biāo)定、量具校正等相關(guān)規(guī)定控制相應(yīng)的風(fēng)險；而如溶液穩(wěn)定性、流動相本底吸收、組分提取等來源的與分析方法有關(guān)的系統(tǒng)誤差，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化至可接受的程度。

 

系統(tǒng)誤差允許的限度，需要結(jié)合分析方法的隨機(jī)誤差進(jìn)行評估，使得分析方法的總誤差不超過根據(jù)外部條件確定的限制。由于系統(tǒng)誤差不能通過復(fù)測減輕，如果方法的系統(tǒng)誤差過大，可能對隨機(jī)誤差的要求就會非常嚴(yán)格。因此應(yīng)當(dāng)評估方法的系統(tǒng)誤差的風(fēng)險，如系統(tǒng)誤差無法優(yōu)化至可接受的程度，則可能需要另行開發(fā)新的方法。

 

溶液穩(wěn)定性

 

溶液穩(wěn)定性的風(fēng)險評估主要從待測組分的降解、稀釋劑的變化（如揮發(fā)、吸收冷凝水）兩個方面進(jìn)行。溶液穩(wěn)定性引入的誤差應(yīng)當(dāng)根據(jù)誤差分配的原理確定相應(yīng)的限度，然而目前對溶液穩(wěn)定性允許的誤差一般同方法驗證的精密度，該要求均過于寬松。如例1中方法允許的總誤差為1%，評價溶液穩(wěn)定性的允許誤差不得設(shè)置為1%，應(yīng)當(dāng)是在扣除其他系統(tǒng)誤差與隨機(jī)誤差后的值，如0.25%。

 

如分析方法存在溶液穩(wěn)定性的風(fēng)險，如能觀察到明顯的待測組分的降解或者稀釋劑的變化，應(yīng)當(dāng)確定相應(yīng)溶液滿足允許的誤差的貯存時間。由于溶液穩(wěn)定性與外界環(huán)境如溫度、濕度等密切相關(guān)，而外界環(huán)境存在不穩(wěn)定的風(fēng)險，因此必要時需研究溶液穩(wěn)定性的耐用性，即在不同環(huán)境條件下分別研究穩(wěn)定性變化的程度與貯存時間，并做回歸分析，提供預(yù)測溶液可用時間的穩(wěn)定性變化程度的置信區(qū)間，其下限應(yīng)不得超過允許的限制。

 

流動相本底吸收

 

對于高效液相色譜法來說，如采用紫外-可見光檢測器，流動相的本底吸收很多時候是一個不可忽視的問題，如檢測波長為小于205nm或者接近流動相的截止波長等情況，特別是對于靈敏度要求較高的雜質(zhì)檢測方法。

 

流動相的本底吸收如果較強(qiáng)，可能會給分析方法帶來許多問題，包括更強(qiáng)的基線噪音、更差的靈敏度、更大的響應(yīng)誤差等，也會給分析方法生命周期中的其他環(huán)節(jié)留下風(fēng)險，如雜質(zhì)檢測的方法驗證中低濃度水平的回收率過低、線性截距過大，或者方法轉(zhuǎn)移過程中對比實驗的檢測結(jié)果相差過大等。

 

為減少流動相本底吸收的風(fēng)險，波長應(yīng)盡量避免較低的波長（＜205nm），或者應(yīng)大于流動相截止波長10nm以上；如波長選擇不能滿足該要求，應(yīng)當(dāng)在方法開發(fā)階段審慎地評估相關(guān)風(fēng)險，必要時進(jìn)行相關(guān)的驗證，并規(guī)定適宜的系統(tǒng)適用性試驗要求。

 

組分提取

 

在對樣品進(jìn)行萃取過程中萃取效果不完全，或衍生化效果不完全，或者在研磨、溶解、過濾等過程中由于輔料、器材的吸附導(dǎo)致待測組分與理想狀態(tài)不一致，對于這類誤差，如果較為嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)首選優(yōu)化樣品處理方法以減輕誤差；完成優(yōu)化后，應(yīng)當(dāng)評估該誤差是否符合被分配的限度。

 

如果優(yōu)化后，組分提取的誤差仍然不能滿足要求，可采用改變計算方法如內(nèi)標(biāo)法減輕該誤差引入的風(fēng)險。

 

五、分析方法的粗大誤差

 

在樣品的檢測過程中，可能會存在多個粗大誤差，如儀器故障、停電、錯誤的計算公式、操作失誤等。這些不同來源的粗大誤差多數(shù)與方法開發(fā)沒有直接聯(lián)系，而是由實驗室的其他相關(guān)管理制度進(jìn)行監(jiān)控，如儀器故障的風(fēng)險應(yīng)當(dāng)由實驗室的儀器維護(hù)等規(guī)程管理。但是其中許多人為因素導(dǎo)致的粗大誤差如使用了錯誤的計算公式、操作失誤等可以在方法開發(fā)期間進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑u估。

 

在分析方法的開發(fā)與設(shè)計時，如果是可選的，則方法應(yīng)考慮到操作不得超過實驗室現(xiàn)有人員的一般水平，設(shè)計的計算方法與樣品處理等內(nèi)容應(yīng)盡可能的簡易，方法使用的設(shè)備、器材、試劑等應(yīng)盡可能為實驗室常用，以減少由于方法過于復(fù)雜導(dǎo)致的粗大誤差發(fā)生的概率。其原則為：如果可以，方法應(yīng)盡可能簡易，為人所熟悉。

6、結(jié)束語

 

 

對分析方法的誤差進(jìn)行設(shè)計，是方法開發(fā)非常重要的一個環(huán)節(jié)，但是目前對此并沒有足夠的認(rèn)識，筆者撰寫本文的目的就是希望提出一些相關(guān)的理念，拋磚引玉，引發(fā)相關(guān)從業(yè)人員對這一環(huán)節(jié)的重視、思考與討論，并逐步完善相關(guān)研究的理論與方法。

 

本文中提起的隨機(jī)誤差、系統(tǒng)誤差、粗大誤差的相關(guān)分類與案例，并未囊括實踐中所有的情況，可按照本文的理念結(jié)合實際情況對實踐中的誤差進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計。